電針聯合烏司他丁對CCl4誘導大鼠急性肝損傷的保護作用及對TLR4/NF-κB信號通路的影響

羅登旭 蔡大川 李佩波

(1重慶市黔江區中醫院內二科,重慶 409000;2重慶醫科大學附屬第二醫院感染科;3重慶市公共衛生醫療救治中心)

急性肝損傷是臨床常見的一種疾病,已嚴重影響患者生活質量,研究表明炎癥反應、氧化應激等是造成急性肝損傷的重要因素〔1,2〕。電針是一種對機體刺激較小的治療方法,可調節機體免疫系統及保護臟器〔3,4〕。但電針對四氯化碳(CCl4)誘導的急性肝損傷的作用機制尚未完全闡明。烏司他丁是一種蛋白酶抑制劑,并可抑制炎癥因子的生成,還可在急性肺損傷等疾病中發揮重要作用〔5,6〕。但電針聯合烏司他丁對CCl4誘導大鼠急性肝損傷的保護作用尚未闡明。Toll樣受體(TLR)4/核因子(NF)-κB信號通路可調控多種炎性介質的釋放從而參與多種炎癥性疾病的發生及發展過程〔7,8〕。本研究采用CCl4誘導大鼠急性肝損傷模型,探討電針聯合烏司他丁對CCl4誘導大鼠急性肝損傷的保護作用及對TLR4/NF-κB信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 健康清潔級雄性SD大鼠,體質量195～245 g,購自重慶市中藥研究院實驗動物研究所,動物許可證號:SCXK(渝)2017-0003。烏司他丁購自廣東天普生化醫藥股份有限公司;四氯化碳(CCl4)購自上海億欣生物科技有限公司;谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)檢測試劑盒購自上海復星長征醫學科學有限公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司;白細胞介素(IL)-12、IL-6檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;兔抗鼠TLR4、p65、p-p65抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2治療方法 60只大鼠隨機選取12只作為正常組,其余50只進行CCl4灌胃處理造模,每組均灌胃0.2 ml CCl4〔9〕,作為模型組。正常組自由飲水與進食。選取造模成功的大鼠隨機分為模型組、電針組、烏司他丁組、聯合組,每組各12只。其中電針組:將大鼠固定在木板上,在雙側足三里穴連接電針儀,頻率1 Hz/s,強度2～4 mA,留針15 min,1次/d,連續治療14 d。烏司他丁組:大鼠腹腔注射烏司他丁注射液〔50 000 U/(k·d)〕,1次/d,連續治療14 d。聯合組:大鼠同時給予電針與烏司他丁治療,連續治療14 d。

1.3采集樣本 第14天將各組大鼠禁食24 h,在大鼠眼球取血,4 ℃、3 000 r/min離心10 min,-20 ℃冰箱內保存離心分離的血清。采用脫頸法處死大鼠,取出肝臟組織,置于-80 ℃超低溫冰箱內保存。

1.4檢測血清ALT、AST、IL-6、IL-12、腫瘤壞死因子(TNF)-α水平與計算肝指數 取出凍存血清,應用全自動生化分析儀檢測血清ALT、AST的水平,嚴格按照試劑盒說明書進行操作。采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清IL-12、IL-6、TNF-α水平。肝指數(%)=肝臟濕質量/大鼠體質量×100%。

1.5檢測肝組織中SOD、MDA水平 取凍存肝組織,加入RIPA裂解液裂解,4 ℃條件下3 000 r/min離心10 min,吸取上清,SOD水平通過黃嘌呤氧化酶法檢測,MDA水平通過硫代巴比妥酸法檢測。

1.6Western印跡檢測肝組織B細胞淋巴瘤(Bcl)-2相關X蛋白(Bax)、Bcl-2、TLR4、p-p65、p65蛋白表達 取出凍存肝組織,用RIPA裂解細胞提取蛋白。通過BCA法測濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將蛋白分離,轉膜、封閉,添加Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、TLR4(1∶800)、p-p65(1∶800)、p65(1∶800)與內參GAPDH(1∶1 000)的一抗稀釋液,4 ℃、24 h,添加二抗稀釋液(1∶2 000),加入增強型化學發光試劑電化學發光(ECL)顯色,通過ImageJ軟件計算蛋白表達量。

1.7統計學處理 采用SPSS26.0軟件進行t檢驗、方差分析,應用LSD-t檢驗組間兩兩差異。

2 結 果

2.1各組肝指數及血清ALT、AST水平 與正常組比較,模型組肝指數顯著降低,血清ALT、AST水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,電針組、烏司他丁組、聯合組肝指數顯著升高,血清ALT、AST水平顯著降低(均P<0.05),且聯合組血清ALT、AST水平顯著低于電針組、烏司他丁組(P<0.05),見表1。

2.2各組肝組織SOD、MDA水平 與正常組比較,模型組SOD水平顯著降低,MDA水平顯著升高(均P<0.05);與模型組比較,電針組、烏司他丁組、聯合組SOD水平顯著升高,MDA水平顯著降低(均P<0.05),聯合組SOD水平顯著高于電針組、烏司他丁組(P<0.05),而MDA水平顯著低于電針組、烏司他丁組(P<0.05),見表1。

2.3各組血清中炎癥因子水平 與正常組比較,模型組IL-6、IL-12、TNF-α水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,電針組、烏司他丁組、聯合組IL-6、IL-12、TNF-α水平顯著降低(P<0.05),且聯合組IL-6、IL-12、TNF-α水平顯著低于電針組、烏司他丁組(P<0.05),見表1。

2.4各組肝組織中凋亡相關蛋白 Bax、Bcl-2水平 與正常組比較,模型組Bax顯著升高,Bcl-2顯著降低(均P<0.05);與模型組比較,電針組、烏司他丁組、聯合組Bax顯著降低,Bcl-2顯著升高(均P<0.05),且聯合組Bax顯著低于電針組、烏司他丁組,Bcl-2顯著高于電針組、烏司他丁組(均P<0.05),見圖1、表2。

表1 各組肝指數及血清ALT、AST及肝組織、SOD、MDA、血清炎癥因子水平

圖1 Western印跡檢測各組肝組織中凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2表達水平

表2 各組肝組織中凋亡相關蛋白 Bax、Bcl-2表達水平

2.5各組肝組織中TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白 與正常組比較,模型組TLR4、p-p65蛋白水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,電針組、烏司他丁組、聯合組TLR4、p-p65蛋白水平顯著降低(P<0.05),且聯合組TLR4、p-p65蛋白水平顯著低于電針組、烏司他丁組(P<0.05),見圖2、表3。

圖2 Western印跡檢測各組肝組織中TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白表達水平

表3 各組肝組織中凋亡相關蛋白 Bax、Bcl-2表達水平

3 討 論

CCl4可引起急性肝損傷,其主要是通過誘導炎癥、氧化應激及凋亡等從而發揮作用,ALT屬于肝細胞內的氨基轉移酶,AST主要存在于心、肝等重要臟器中,研究表明ALT、AST水平升高與肝損傷程度呈正相關〔10〕。本研究結果提示,電針與烏司他丁聯合治療可有效降低ALT、AST的水平及改善大鼠肝指數從而對肝組織發揮保護作用。

電針可有效促進血液循環及改善機體新陳代謝,還可調整機體臟器內酶系、電解質等從而減輕肝臟等臟器損傷〔11〕。烏司他丁可抑制多種蛋白酶及清除氧自由基、炎癥因子的釋放,并可抑制相關信號通路的活化從而減輕肺組織損傷〔12〕。SOD、MDA屬于氧化應激重要指標,并可作為評估肝氧化損傷的重要指標,其中MDA屬于脂質過氧化物,并可加重肝臟脂質過氧化損傷,SOD屬于抗氧化酶類,并可清除氧自由基〔13〕。本研究結果提示,電針與烏司他丁聯合治療可提高SOD水平及降低MDA水平而抑制脂質過氧化反應,并可增強機體抗氧化能力。TNF-α、IL-6、IL-12是常見的促炎因子,可提高炎癥水平進而產生機體損傷〔14,15〕。本研究結果提示,電針與烏司他丁聯合治療可顯著抑制炎癥因子的分泌從而減輕CCl4誘導大鼠急性肝組織炎癥損傷。

Bax和Bcl-2是蛋白凋亡相關蛋白,它們與線粒體途徑調控細胞凋亡有關〔16〕。本研究結果提示,電針與烏司他丁聯合治療可能通過抑制細胞凋亡從而保護肝組織。TLR4、p-p65、p65是TLR4/NF-κB信號通路的主要蛋白,其激活后可促進炎癥反應從而造成肝損傷或肺損傷〔17,18〕。本研究結果提示,電針與烏司他丁聯合治療可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路的活化從而減輕CCl4誘導大鼠急性肝損傷。

綜上,電針聯合烏司他丁可抑制氧化應激、炎癥反應及凋亡從而減輕CCl4誘導大鼠急性肝損傷,其機制可能跟抑制TLR4/NF-κB通路有關,可為急性肝損傷的治療提供新方向。