阿爾茨海默病患者皮層金屬離子轉運基因的生物信息學特征

汪麟雙 衛小蝶 邵玲俐 張俊英 張占軍 李鵬博 孔令竹 徐曉宇 林東飛 衛東鋒

(1中國中醫科學院中醫臨床基礎醫學研究所,北京 100700;2首都醫科大學附屬北京佑安醫院;3北京大學第三醫院北方院區;北京師范大學 4認知神經科學與學習國家重點實驗室;5老年腦健康研究中心;6重慶醫科大學中醫藥學院;7中國中醫科學院中醫藥信息研究所)

阿爾茨海默病(AD),又稱老年性癡呆,是一種與衰老密切相關的神經退行性疾病,臨床表現主要為漸進性的認知和記憶功能減退、定向不準確、判斷能力喪失、語言表達能力喪失、缺乏邏輯判斷能力、意識模糊、人格分裂和情感改變等認知功能慢性和持續性障礙〔1〕。目前全世界癡呆患者人數已高達5 000萬以上,預計2050年將達到1.154億人,其中50%～70%為AD患者。隨著人口老齡化加劇,我國AD患者已超過1 000萬〔2〕。目前AD發病機制主要包括以下幾種假說,包括:①淀粉樣蛋白-β(Aβ)級聯假說,認為Aβ寡聚體導致突觸損傷,神經元丟失;②Tau蛋白過度磷酸化異常集聚,產生神經元纖維纏結(NFT);③金屬離子平衡紊亂假說,認為大腦中的金屬離子轉運蛋白異常表達導致鈣、鐵、銅、鋅等金屬離子在關鍵腦區分布異常,并引起氧化應激、細胞自噬等,進而損傷神經元胞體及軸突;④膽堿能假說;⑤能量代謝紊亂假說〔3〕。AD患者皮層金屬離子代謝紊亂是導致認知功能障礙的重要原因之一。Roy等〔4〕研究表明,AD大腦組織中的金屬離子與Aβ蛋白螯合聚集在老年斑核心及邊緣。AD腦組織中金屬離子代謝紊亂可導致神經元內質網應激、線粒體損傷、自噬功能障礙,這些病理又反向加劇金屬離子分布不均及沉積,引起Aβ和Tau蛋白聚集,導致神經突觸可塑性降低和神經元丟失〔5,6〕。

Mirza等〔7〕研究表明,家族性AD患者腦組織中的鋁含量明顯增多。隊列元分析結果表明,AD患者腦組織、血清及腦脊液中的鋁含量顯著升高,提高鋁的暴露程度使得AD風險增加71%。Aβ-鋁耦合物可增加大量Aβ寡聚物的生成,并上調AD相關基因,如淀粉樣前體蛋白(APLP)1和APLP2、微管相關蛋白Tau(MAPT)及β淀粉樣前體蛋白(APP)〔8〕。當銅離子介導氧化還原反應時,也會產生一定的細胞毒性,可能導致神經變性〔9〕。目前,基因芯片微陣列技術和生物信息學分析已廣泛應用于組學大數據深度挖掘和AD發病過程的機制研究〔10,11〕。本研究應用基因表達公共數據庫(GEO)AD患者皮層中具有明顯差異表達的基因數據,采用基因本體論GO分析和蛋白-蛋白相互作用(PPI)等方法進行生物信息學分析,深入探討早期AD患者皮層中與金屬離子代謝相關的差異基因分子功能和蛋白相互作用網絡特征。

1 材料和方法

1.1材料 采集基因芯片數據,在GEO DataSets Advanced Search Builder搜索框中以“皮層和阿爾茨海默病”為檢索詞,獲得GSE39420、GSE48350和GSE11882基因芯片數據。GSE39420為人類后扣帶回區基因組RNA表達譜,采用商業化Affymetrix人類外顯子1.1 ST芯片平臺GPL11532進行檢測,該芯片包含了7例AD患者和10例健康對照。GSE48350和GSE11882基因芯片數據為人類腦組織基因芯片數據,該數據采用商業化Affymetrix人類基因組U133 Plus2.0芯片平臺GPL570檢測,GSE48350芯片包含81例AD患者,GSE11882芯片包含63例健康對照。

1.2差異表達基因分析 將GSE39420、GSE48350及GSE11882芯片中共73例正常人作為對照組,88例AD患者作為模型組,應用GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)的R語言程序對3個基因芯片數據進行分析。AD組與對照組間差異基因的篩選標準為基因表達量變化倍數|FC|≥1.2且組間差異顯著(P<0.05)。本研究選擇其中的金屬離子轉運相關基因進行分析。

1.3差異基因表達蛋白的PPI調控網絡分析 將30個差異基因表達的蛋白上傳至STRING11.0 PPI-關系在線分析網站(http://www.string-db.org),通過調節可信度及附件節點參數,分析得到差異基因表達蛋白的PPI拓撲網絡圖譜及團簇生物功能分類網絡圖譜。進一步采用Cytoscape3.8.2軟件及Cytohubba插件對調節金屬蛋白酶水解和調節電壓依賴性鈣通道PPI子網絡蛋白的度值進行分析,并篩選子網絡中的關鍵節點蛋白。

1.4差異表達基因的基因本體GO富集分析

1.4.1差異表達基因的分類及分子功能分析 將30個差異基因上傳至PANTHER16.0在線分類系統(http://www.pantherdb.org),通過調節數據種屬類型及分析類型參數,調節結果展示圖形類別,分別獲得差異基因表達蛋白的分類結果和分子功能分類結果,進一步查看各分類中的詳細基因名稱及相關信息,對結果進行整理。

1.4.2差異表達基因的生物學過程及信號通路分析 在上述數據上傳的基礎上,進一步調節分析參數及結果展示類型,點擊各生物學過程及信號通路分析結果,查看各生物學過程中所包含的所有基因名稱及其詳細信息,并查看每條信號通路中所涉及的基因數量、基因名稱等相關信息。

1.5差異基因GO功能簇間的相互作用 將30個差異基因上傳至Metascape在線基因注釋與分析系統(https://metascape.Org/gp/index.html#/main/step1),對基因功能簇間相互作用進行分析,篩選差異基因富集度較高且相似度>0.3的基因功能簇構建相互作用網絡,并篩選重要的基因功能簇。

2 結 果

2.1差異基因分析 如表1所示,通過組間基因表達分析,從AD患者皮層組織中篩選出30個與金屬離子轉運密切相關的差異基因,這些基因的表達均上調。

表1 AD患者皮層中與金屬離子轉運相關的30個差異表達基因

2.2差異基因表達蛋白的PPI拓撲網絡及子網絡蛋白度值 如圖1所示,STRING蛋白相互作用在線分析結果表明,30個上調基因表達的蛋白之間存在相互作用關系,網絡中預測的相關功能蛋白為甲基丙二酸單酰輔酶A變位酶(MUT)、鈣通道電壓依賴性β1蛋白抗體(CACNB1)、鉀離子通道相互作用蛋白(KCNIP)1、KCNIP2、電壓門控性鉀通道E亞家族,成員(KCNE)1、基質金屬蛋白酶(MMP)3、MMP9、電壓依賴性鈣通道γ1亞基(CACNG1)、電壓依賴性鈣通道β2亞基(CACNB2)、MMP1、KCNE2、Discs同源物(DLG)4、N-甲基-D-天冬氨酸受體亞基(GRIN)2B、GRIN2A、線粒體內膜移位酶亞基Tim(TIMM)13。如圖2所示,團簇生物功能網絡分析結果表明,PPI拓撲網絡中包含3個不同生物功能的子網絡,分別與調節金屬蛋白酶水解(紅色)、調節電壓依賴性鈣通道(藍色)、介導跨膜蛋白進入線粒體內膜(綠色)相關。調節金屬蛋白水解子網絡中各節點蛋白的度值:電壓門控鉀離子通道亞家族D成員(KCND)2(度值10);KCNIP2、GRIN2B、GRIN2A、GRIN1、DLG4(度值7);電壓門控性鉀通道H亞家族成員(KCNH)2(度值6);KCND3、GRIN3A(度值5);KCNE1、KCNE2、KCNIP1、Disks大同源物關聯蛋白(DLGAP)1、神經突觸黏附樣分子(LRFN)1(度值4);KCND1(度值3);TIMM8A、TIMM23、TIMM10Disks大同源物關聯蛋白(度值2)。KCND2為該子網絡的中心節點,度值為10,與子網絡中的其他10個蛋白存在相互作用關系。GRIN1、KCNIP2、GRIN2B、GRIN2A及DLG4度值為7,為網絡的關鍵節點,見圖3。調節電壓依賴性鈣通道子網絡中各節點蛋白的度值:電壓依賴性鈣離子通道蛋白亞基α(CACNA)1C(度值10);電壓依賴性鈣通道γ1亞基(CACNG)1、CACNB2、CACNB1、CACNA2D2、CACNA2D1、CACNA1D(度值6)。瞬時受體電位陽離子通亞家族M成員(TRPM)7、溶質載體家族6成員(SLC6A)8、壓力型機械敏感性離子通站道組分(PIEZO)1(度值1)。CACNA1C為該子網絡的中心節點,度值為7,與子網絡中的其他7個蛋白存在相互作用關系,CACNB2,CACNA2D1、CACNA1D、CACNB1、CACNA2D2和CACNG1度值均為6,為網絡的關鍵節點,見圖3。刪除這些關鍵節點,則網絡結構渙散。這些子網絡關鍵節點的基因表達量見表2,其中GRIN2B、GRIN1、CACNB2、DLG4的變化倍數較大。

2.3差異基因的GO分類 差異基因的GO分析結果包括基因表達蛋白的分類(蛋白總數30,分類匹配數目18)、分子功能(匹配數目24)、生物學過程(匹配數目30)及信號通路(匹配數目6)。

2.3.1差異基因表達蛋白的分類和分子功能分析 PANTHER系統蛋白分類結果表明,差異基因表達的蛋白可分為4個類別,包括基因特異性轉錄調節因子、蛋白結合活性調節因子、跨膜信號受體及轉運蛋白,每種類別包含的基因及占總基因數量的百分比見表3。分子功能分析結果表明,差異基因的分子功能可分為4個類別,包括結合活性、催化活性、分子傳導及轉運活性,每種分子功能包含的基因及占總基因數量的百分比見表3。

圖1 差異基因表達蛋白的PPI拓撲網絡

圖2 差異基因表達蛋白的相互作用團簇圖

網絡拓撲圖中代表蛋白的圓形節點面積、顏色深度與其相關性度值呈正相關圖3 子網絡度值

表2 網絡關鍵節點蛋白的基因表達信號值

2.3.2差異基因的生物學過程和信號通路分析 PANTHER系統生物學過程分類結果表明,差異基因的生物學過程可分生物調節過程、細胞過程、定位過程及代謝過程,每種生物學過程包含的基因及占總基因數量的百分比見表3。差異基因主要涉及腎上腺素和去甲腎上腺素的生物合成信號通路、α腎上腺素能受體信號通路、離子型谷氨酸受體信號通路、毒蕈堿型乙酰膽堿受體2和4信號通路及煙堿乙酰膽堿受體信號傳導信號通路,每條信號通路包含的基因及占總基因數量的百分比見表3。

表3 差異基因表達蛋白的分類和分子功能及生物學過程和信號通路

2.4差異基因GO功能簇間的相互作用分析 如圖4所示,Metascape在線分析系統富集得到差異基因功能簇之間的相互作用網絡圖,其中富集程度較高的GO基因功能簇包括無機陽離子跨膜轉運、鈉離子跨膜轉運、鉀離子跨膜轉運、離子穩態、神經系統、陰離子轉運、膜電位調節及溶質載體介導的跨膜轉運。功能簇間的相互作用分析結果表明,神經元系統、膜電位調節、細胞離子穩態、小分子轉運及細胞金屬離子穩態與多個基因功能簇之間具有相互作用關系。

3 討 論

研究表明,腦組織中金屬離子穩態在維持腦的正常生理功能和認知功能方面具有非常重要的作用。部分細胞跨膜轉運體、金屬離子調節因子及金屬離子伴侶蛋白能夠保護和引導金屬離子到達目的地〔12,13〕。腦內金屬離子轉運體異常可直接或間接地影響多種細胞途徑,加重金屬離子轉運和沉積異常。AD患者腦組織中金屬離子代謝紊亂是導致神經網絡失連接和認知功能障礙的主要原因之一〔14,15〕。金屬離子轉運蛋白、傳感因子及其伴侶蛋白表達異常可引起腦組織中金屬離子代謝障礙,而金屬離子失衡可加速Aβ沉積和磷酸化Tau蛋白聚集,導致NFT、神經元丟失、突觸可塑性降低,進而導致AD的發生和發展。

AD患者腦內鐵、銅、鋅、鈣等金屬離子在不同腦區過量沉積,導致老年斑生成增多〔16,17〕。金屬離子在大腦內錯誤沉積導致氧化應激,而離子失衡與氧化應激可通過激活β-或γ-分泌酶、抑制α-分泌酶,協同或獨立地促進Aβ過量產生〔18,19〕。載脂蛋白(Apo)E4基因是AD的危險因素〔20〕,微量金屬離子和一氧化氮含量異常會影響ApoE4基因的表達,導致AD患病率上升〔21,22〕。相關研究表明〔23,24〕,AD患者腦內多種鐵代謝相關蛋白表達異常會導致腦內鐵沉積,促使氧自由基生成,加重腦組織的氧化應激損傷。本研究中的皮層基因數據來源于AD患者皮層組織,篩選出的差異基因與皮層組織中金屬離子代謝紊亂密切相關,包括電壓依賴性鈣離子通道亞基α2/δ1(CACNA2D1)、N-甲基-D-天冬氨酸離子能谷氨酸受體1、壓力型機械敏感性離子通道組分1、瞬時受體電位陽離子通道亞家族M,成員7、溶質載體家族6,成員8、鋅指蛋白318等。STRING分析結果表明,AD患者皮層中與離子轉運相關的差異基因表達的蛋白之間存在相互作用關系,PPI網絡中包含7個關鍵節點蛋白,分別為CACNA2D1、GRIN1、GRIN3A、電壓門控鉀離子通道亞家族D(KCND)3、電壓門控鉀離子通道亞家族(KCN)Q1及KCNQ5。

溶質載體基因表達的溶質載體轉運蛋白是哺乳動物細胞膜蛋白的主要亞群之一,包括400多種跨膜溶質載體。這些膜蛋白利用H+與Na+梯度作為動力,將血液中的底物逆濃度梯度運輸到腦細胞內部,滿足大腦對能量和營養的較高需求〔25〕。本研究中篩選出12個溶質載體家族基因,占所有差異基因的25%。溶質載體轉運蛋白在神經退行性疾病中起著重要作用,可調節神經遞質γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸、5-羥色胺、多巴胺和去甲腎上腺素在突觸區域的濃度〔26〕。其中,溶質載體家族(SLC)6也被稱為神經遞質轉運體,可維持中樞神經系統中的抑制性神經遞質GABA、甘氨酸與興奮性神經遞質谷氨酸之間的平衡〔27〕。

鋅指蛋白(ZNF)家族是人類基因組中最大的轉錄因子家族,具有多種生物學功能。單倍型區塊定量性狀分析結果表明,ZNF827的單倍型區塊與腦脊液中Aβ42的濃度相關。研究表明,ZNF突變體可對認知功能和神經影像學表型產生重要影響,如ZNF804A基因與額、顳葉灰質密度降低導致的認知障礙患者的認知功能損傷密切相關,能夠影響神經突起生長、突觸形成和多巴胺能傳遞相關基因的表達水平,在神經遷移、軸突生長和突觸形成等過程中發揮重要作用〔28,29〕。本研究差異基因的生物信息學分析結果表明,AD患者皮層中的金屬離子轉運相關差異基因主要涉及結合活性、催化活性、分子傳導及轉運活性,通過調節α腎上腺素能受體、離子型谷氨酸受體、毒蕈堿型乙酰膽堿受體、煙堿乙酰膽堿受體信號傳導信號通路參與生物調節、細胞過程、定位過程及代謝生物學過程,為早期AD研究提供了新思路和防治靶標。

綜上,應用生物信息學和相關性分析方法對AD患者皮層組織中金屬離子轉運基因進行了深入分析,篩選出了7個重要調節基因,分別為CACNA2D1、GRIN1、GRIN3A、KCND3、KCNQ1和KCNQ5,以離子型谷氨酸受體信號通路為主,針對這些差異基因及其表達的蛋白進行深入研究,將有助于進一步揭示皮層金屬離子轉運基因在AD早期階段的重要作用,并為AD的早期篩查和靶向治療提供科學依據。