基于調控NF-κB信號通路探討白藜蘆醇影響DCs成熟對恢復COPD小鼠Th17/Treg平衡的作用及機制

唐斌 李秋根 李凡 尹祖安 陳婷 凌友亮 黃丹

(江西省人民醫院(南昌醫學院第一附屬醫院) 1呼吸與危重癥醫學科,江西 南昌 330006;2急診科;3南昌大學第二附屬醫院麻醉科)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)發病機制復雜,T淋巴細胞、樹突細胞(DCs)等都參與了COPD的發病過程。其中輔助T細胞(Th)17和調節性T細胞(Treg)是一種相關聯的淋巴細胞亞群,二者均來源于CD4+T細胞,但功能上是相互拮抗的。Th17/Treg失衡是COPD發展的關鍵點之一,Th17/Treg比值失衡向Th17方向偏移,促進COPD進展〔1,2〕。DCs成熟與Th17/Treg平衡有關,成熟DCs(mDCs)可以造成CD4+T細胞向Th17分化,而未成熟的DCs(iDCs)則可誘導Treg分化。在COPD中,iDCs水平下調,mDCs水平上升。iDCs介導免疫耐受,導致Treg升高,Th17降低〔3〕。研究揭示白藜蘆醇通過抑制核因子(NF)-κB活性,減少NF-κB亞基RelA/P65表達或減少P65核移位而發揮抗炎作用〔4〕。然而,尚不清楚白藜蘆醇在調控NF-κB信號通路而影響DCs功能狀態中的作用及其與COPD中Th17/Treg平衡的可能關系,本研究旨在探討白藜蘆醇影響DCs成熟對恢復COPD小鼠Th17/Treg平衡的作用與機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及其分組 36只SPF C57BL/6雌性野生型小鼠,6～8周齡,體質量20～25 g,從南昌大學實驗動物科學中心采購。飼養溫度25～26 ℃,60%～70%相對濕度,投喂塊狀食物,小鼠飲水自由,墊料每周更換2次。采用隨機數字表法分成健康對照組、COPD組和白藜蘆醇干預組各12只。本研究取得醫院倫理委員會批準,所有動物飼養及實驗操作符合相關管理要求準則及實驗動物倫理要求。

1.2動物模型制備 COPD小鼠模型制作方法:采用香煙煙霧刺激和氣道注射脂多糖(LPS)制備COPD模型,分別于第1、15天氣道內注射LPS溶液(200 μg/200 μl);第2～28天(除第15天外)在造模箱(玻璃制成,25 cm×35 cm×80 cm,盒子頂部有一個直徑約2 cm的通氣孔,盒子中間有兩排從下往上的鐵網,鐵網之間放置并點燃香煙中被動吸煙(2次/d,12支/次),同一天兩次被動吸煙的間隔時間為2 h,COPD 組注射LPS當日呼吸新鮮空氣,不給予上述煙霧刺激處理。健康對照組:正常飼養,不予上述處理。白藜蘆醇干預組:造模方法同COPD組,同時給予25 mg/kg白藜蘆醇灌胃。其余兩組與白藜蘆醇同等劑量生理鹽水灌胃。

1.3動物處理及外周血、支氣管肺泡灌洗液(BALF)、肺組織標本收集及骨髓源性DCs的提取 (1)外周血:在實驗的第28天,小鼠清醒時采集內眥靜脈叢1 ml血液,采集的外周血樣本立即放入肝素抗凝管中,待用于流式細胞術檢測。(2)BALF及肺組織:各組小鼠末次激發24 h后,10%水合氯醛400 mg/kg ip麻醉,分離氣管,用0.3 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗右肺3次,收集BALF, 4 ℃ 12 000 r/min離心10 min,將上清液置于-80 ℃冰箱中保存以備檢測,用1 ml PBS重懸細胞。取重懸液10 μl進行涂片染色、炎癥細胞計數、分類。切取左肺門附近肺組織,厚度2～3 mm,滅菌后用0.9%氯化鈉注射液消毒清洗血漬,用10%甲醛固定。此外,取一些新鮮的肺組織,在液氮中速凍后,置于滅菌的PE管中,置于-80 ℃冰箱冷凍備用。(3)骨髓源性DCs:采用脫頸法對小鼠實施處死,分離并去除股骨、脛骨骨骺端。用PBS沖洗骨髓,用離心機1 000 r/min離心5 min,丟棄上清,將PBS再次混勻底部的細胞沉淀,以混勻的細胞液與淋巴細胞分離液一起以2 000 r/min離心20 min。提取骨髓基底細胞層,PBS洗滌3次,留取備用。

1.4流式細胞術檢測外周血、BALF中DCs成熟標志物及Th17/Treg比值 采用直接標記的流式抗體,采用雙色熒光標記法測定外周血、BALF中DCs成熟標志物〔人類主要組織相容性復合物(MHC)-Ⅱ、CD80、CD86水平〕及Th17/Treg比值,詳細步驟見試劑盒說明書。檢測是在相同的儀器參數下進行的,激發波長488 nm,每個樣本收集20 000個細胞,Cell Quest Plot軟件分析數據,包括外周血檢測單個核細胞中CD80、CD86、MHC-Ⅱ的表達量,有細胞中CD80、CD86、及MHC-Ⅱ表達量均以百分率(%)表示,比較DCs各因子測定管減去陰性對照管的百分率。用CD4+CD25+Foxp3+標志物鑒定Treg細胞,用CD3+CD8-白細胞介素(IL)-17A+標志物鑒定Th17細胞。用FSCAN流式細胞儀測定Th17/Treg比值,并用BD-FACS-Diva 軟件進行分析。

1.5病理標本的制備及染色 用10%甲醛固定的新鮮肺組織,進行常規的脫水,透明,用蠟浸漬,制備蠟塊,染色,并在光學顯微鏡下觀察。

1.6逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測 DCs中 NF-κB 的表達 先用Trizol試劑提取3組 DCs的總RNA,(根據試劑盒說明書操作);然后應用TaKaRa公司逆轉錄試劑盒將提取的RNA逆轉錄為cDNA,然后對其進行進一步檢測。

1.7統計學方法 采用SPSS25.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1肺組織病理結構 健康對照組支氣管壁光滑完整,肺組織、氣道及血管周圍未發現炎癥細胞浸潤。COPD組氣道壁被炎性細胞浸潤,細支氣管顯示出纖毛倒伏、縮短、粘連,其上皮黏液杯狀細胞增生,明顯出現肺氣腫,可見形成的肺大泡。白藜蘆醇干預組與COPD組相比有所改善,炎癥細胞浸潤減少,肺氣腫和肺大泡也有所改善。見圖1。

2.2外周血、BALF中DCs成熟標志物及Th17/Treg比值 3組外周血及BALF中CD80、CD86、TH17/Treg水平比較:COPD組>白藜蘆醇干預組>健康對照組(均P<0.05);3組外周血及BALF中MHC-Ⅱ水平比較:健康對照組>白藜蘆醇干預組>COPD組(均P<0.05)。見表1。

圖1 各組氣道炎癥的病理改變(HE染色,×20)

表1 各組外周血和BALF中CD80、CD86、MHC-Ⅱ水平及Th17/Treg比較

3 討 論

COPD的發病機制復雜,自身免疫機制也在一定程度上參與了COPD的發生發展,T淋巴細胞介導的自身免疫在COPD發病中發揮重要作用,特別是Th17和Treg及其比值〔5,6〕。DCs是體內最重要的抗原遞呈細胞(APCs),DCs在誘導Th17/Treg細胞軸的免疫平衡中起關鍵作用,從而在COPD的炎癥過程中起關鍵作用。不同的刺激可以誘導不同的DCs成熟狀態,從而刺激T細胞不同的功能狀態,有研究報道,髓iDCs表面缺乏CD40、B7等黏附輔助分子,導致T細胞失活和低反應,并可誘導Treg產生,呈現顯著的免疫耐受〔7〕。NF-κB是決定DCs功能狀態的關鍵因素〔8〕。相關研究表明,NF-κB參與細胞增殖和分化、衰老、死亡、黏附和遷移〔9〕。Yu等〔10〕報道細胞外腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)激活P2x7R-NF-κB通路促進小鼠髓源性DCs成熟。韓旭〔11〕研究表明,阻斷 LPS-TLR4/NF-κB 信號傳導通路,可抑制DCs成熟,繼而增加其耐受性。白藜蘆醇是一種多酚類植物抗毒素,它廣泛分布在自然界,具有調節免疫、抗氧化、抗炎、自由基清除、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等功能〔12〕。對COPD、支氣管哮喘、肺纖維化、肺動脈高壓等有抗炎、抗氧化作用〔13〕。白藜蘆醇可負向調節NF-κB、轉錄激活蛋白-1等信號通路,它可減輕COPD炎癥細胞的激活和炎癥因子如IL-8和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的釋放〔14〕。本研究結果提示,白藜蘆醇可抑制NF-κB信號通路而阻斷DCs成熟,從而恢復COPD小鼠Th17/Treg的平衡,繼而延緩COPD小鼠氣道炎癥的進展。有文獻報道,白藜蘆醇可以通過負調節NF-κB的表達來調節抗氧化酶的活性〔15〕。Mohammadpou等〔16〕研究表明,呼吸道合胞病毒(RSV)可能通過RelA和c-Jun基因調控降低NF-κB和轉錄激活因子(AP)-1活性。Buttari等〔17〕報道,白藜蘆醇體外預處理人單核細胞衍生的DCs可防止DCs成熟,其通過免疫化學和細胞熒光分析發現白藜蘆醇對DCs表面成熟標志物上調有抑制作用,還抑制DCs中的促炎細胞因子表達、同種異體刺激能力上調、絲裂原活化蛋白激酶和NF-κB活化。本研究說明,白藜蘆醇能夠通過抑制NF-κB信號通路而阻斷DCs成熟從而恢復COPD小鼠Th17/Treg的平衡,在延緩COPD小鼠氣道炎癥的發生發展中起重要作用。