基于HMGB1/TLR4信號通路使用迷走神經刺激治療難治性癲癇的效果

張冬 梁振 李永格

(1南陽醫學高等專科學校基礎醫學部,河南 南陽 473061;2河南省腫瘤醫院神經外科)

難治性癲癇的主要特點是存在腦部反復發作癲癇的可能性〔1〕,相關研究顯示,迷走神經刺激(VNS)是當下治療難治性癲癇的有效治療手段之一。VNS又被稱為自主神經刺激,可顯著減少癲癇的發作次數〔2,3〕。因此,大部分研究學者認為VNS會有效提升難治性癲癇患者的生活質量。高遷移率族蛋白(HMG)B1廣泛分布在真核細胞中,在癲癇發作中,它會從受損膠質細胞和神經元中活化內皮細胞,引發炎癥反應,讓血液及膠質細胞中的各種免疫細胞功能受限〔4〕。在癲癇發作后,星形膠質細胞、神經元中Toll樣受體(TLR)4會得到活化,進而會引發神經性炎癥,進而它會與HMGB1組成信號通路來參與癲癇的發生、發展〔5,6〕。本文主要通過VNS來分析其對HMGB1/TLR4信號通路是否有調控作用,同時在證實VNS治療難治性癲癇的療效是否顯著。

1 材料與方法

1.1研究動物 選擇40只清潔級健康成年SD大鼠,雌雄各半,體質量230～255 g,均由中國醫學科學院實驗動物中心提供,合格證號為:SCXK(京)2021-0008。實驗前,適應性喂養1 w,采用開放喂養系統,遵循自然規律進行光照照射,室溫保持24～26 ℃,喂養標準實驗室大鼠食物飼料及自來水,讓大鼠適應實驗環境中對動物的取材、飼養、手術等。主要試劑及儀器:氯化鋰、匹魯卡品、東莨菪堿(美國sigma公司),苯巴比妥鈉(PB,上海新亞藥業),戊巴比妥鈉溶液(武漢純度生物科技有限公司),多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(PBS,廣州美基生物科技有限公司),電生理信號采集器(Digidata1440A,美國Axon Instruments公司),可粘貼性皮膚刺激電極片(直徑5 mm,自制),數字脈沖刺激器(Master-8/Iso-flex,美國AMPI公司),80-2型低速離心機(上海手術器械廠),紅外視頻監測系統(上海景陽監控,型號SR-TX420-SL),蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(武漢谷歌生物科技公司),HMGB1、TLR多克隆抗體購自亞科因(武漢)生物技術有限公司,免疫組化檢測試劑盒購自福州邁新公司。石蠟切片機(RM2245,德國Leica公司),光學顯微鏡(Leica公司)。

1.2分組、建模 將40只大鼠隨機分為空白對照組(A組)、難治性癲癇模型組(B組)、假刺激組(C組)、VNS組(D組),每組各10只。

難治性癲癇大鼠模型的建立:向B、C、D組腹腔內注射濃度為1 mol/L的氯化鋰3 mmol/kg,19.5 h后再向這些大鼠皮下濃度為0.5 g/L的1 mg/kg注射東莨菪堿,半小時后向腹腔注射濃度為10 g/L的匹魯卡品30 mg/kg,空白對照組腹腔注射0.9%生理鹽水30 mg/kg。使用匹魯卡品的大鼠大約會在注射半小時后出現持續癲癇,等癲癇持續1 h后注射地西泮(安定)10 mg/kg讓大鼠終止發作。利用監控系統檢測建模成功后大鼠癲癇的發展情況,等14 d后大鼠均進入癲癇自主發作階段。

迷走神經分離術:向C、D組大鼠腹腔內注射濃度為25%的烏拉坦4 ml/kg,讓大鼠仰臥手術臺,在其頸部備皮,正中切口長度保持5 cm,切口涉及大鼠淺筋及皮膚,沿其左側胸骨骨肌進入左側頸動脈鞘,利用玻璃針分開頸動脈鞘,游離左側迷走神經。將自制C型雙極銀質電極刺激端置于大鼠迷走神經干上,兩電極距離為1～2 mm,將無菌恒溫石蠟油棉條固定在大鼠游走神經干,置于C型電極凹槽內,縫合傷口,通電刺激時,電刺激器與C型電極遠端連接。

1.3方法 A組、B組不作任何刺激處理,C、D組大鼠左耳部剃毛,左頸部植入VNS電極,C組不刺激通電。D組進行通電刺激,VNS刺激參數設置為:電流控制在0.25～1.0 mA之間,波寬為500 μs,頻率為25 Hz,刺激時間為30 s,刺激時間為12 h(08∶00～20∶00),間歇為5 min,連續刺激28 d,在大鼠進行刺激之前使其適應刺激環境,電流由0.25 mA逐漸增加,1 w后提高到最大值1.0 mA,利用電腦視頻系統監測大鼠癲癇發作狀況。

1.4指標觀察 42 d后,按照40 mg/kg的比例將1%戊巴比妥鈉溶液注射大鼠腹腔進行麻醉,靜待大鼠麻醉成功后,主動脈取血5 ml,將血樣以14 000 r/min的速度離心5 min,沉淀蛋白質,吸取上清液經0.45 μm微孔濾膜過濾備用。①處死大鼠,用4%多聚甲醛PBS灌注斷頭取腦,取大鼠海馬組織進行HE染色。在光學顯微鏡高倍視野(×400)下隨機選取CA3區4個不重復視野,觀察各組大鼠細胞數量、核仁狀態、存活錐體細胞數、陽性細胞數等,應用計算機病理圖像分析系統 Image Pro Plus6.0 分析。②利用24 h電腦監控系統記錄刺激前1 w及刺激后1 w B、C、D組癲癇發作頻率(癲癇持續時間超過30 s)。③采用免疫組化檢測單核趨化蛋白(MCP)-1、層黏連蛋白(LAP)、P糖蛋白(gp)。在海馬部位灰度比值,將切片常規脫蠟水化,于60 ℃恒溫箱中烘烤1.5 h,加入二甲苯浸提10 s,自來水沖洗3 min后用PBS沖洗3次,加入0.01 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液,冷卻后用PBS沖洗,加入3%H2O2覆蓋切片組織表面,37 ℃避光恒溫箱孵育10 min,棄一抗,取出,置于4 ℃冰箱中過夜,然后二抗孵育后置入37 ℃恒溫箱孵育30 min,PBS沖洗3次,1次/3 min,擦干,甩掉二抗,PBS沖洗3次,每次3 min,加入二氨基聯苯胺(DAB)顯色液,光鏡下觀察顯色程度,讀取表達后計算比值。④Western印跡檢測海馬組織HMGB1、TLR4蛋白的表達。取50 mg海馬組織,用Western印跡提取組織總蛋白,調整蛋白質濃度,經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、膜轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,加入對應一抗,于4 ℃條件下孵育過夜,TBST漂洗40 min,分為3次漂洗,再加入經(HRP)標記的二抗繼續孵育1 h,根據電化學發光(ECL)試劑盒說明書對蛋白條帶進行顯影、定影,觀察、分析各組蛋白條帶成像情況。

1.5統計學處理 采用SPSS25.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1大鼠海馬CA3區觀察 大鼠海馬CA3區HE染色結果如圖1所示,形態正常,排列整齊,核仁清晰;與A組相比,B組海馬CA3區細胞數量最少,且出現形態的嚴重損傷,核仁溶解、縮小、模糊不清,核斷裂現象嚴重;與B組相比,C組癥狀無明顯區別,神經元細胞數量及核仁狀態都受損嚴重;D組則有明顯變化,細胞數量大幅度增加、形態趨于正常,核仁狀態恢復良好。

2.2大鼠每周癲癇發作次數比較 刺激前1 w,B、C、D組癲癇發作頻率無統計學差異(P>0.05);刺激結束后1 w,與B、C組相比,D組刺激結束后癲癇發作頻率顯著減少(P<0.05)。見表1。

2.3大鼠海馬組織存活錐體細胞數、陽性細胞數 與A組相比,B組、C組、D組海馬組織存活錐體細胞數明顯減少、海馬組織陽性細胞數明顯增加(P<0.05);與B、C組相比,D組海馬組織存活錐體細胞數明顯增加,海馬組織陽性細胞數明顯減少(P<0.05)。見表1。

2.4大鼠海馬區MCP-1、LAP、P-gp灰度比值比較 與A組相比,B組、C組、D組海馬區MCP-1、LAP、P-gp灰度比值明顯增加(P<0.05);與B、C組相比,D組海馬區MCP-1、LAP、P-gp灰度比值明顯降低(P<0.05)。見表1。

圖1 各組海馬CA3區(HE染色,×400)

表1 各組每周癲癇發作次數、海馬組織存活錐體細胞數、陽性細胞數、海馬區MCP-1、LAP、P-gp灰度比值比較

2.5HMGB1、TLR4蛋白表達比較 與A組相比,B組、C組、D組海馬區HMGB1、TLR4表達增加,差異有統計學意義(P<0.05);與B、C組相比,D組海馬區HMGB1、TLR4表達降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 HMGB1、TLR4蛋白表達比較

圖2 Western印跡檢測各組HMGB1、TLR4蛋白表達

3 討 論

癲癇以短暫性、陣發性、突發性、反復發作的大腦功能性障礙為主要表現特征〔7,8〕。雖然當前臨床上,有各種各樣的抗癲癇藥物不斷取得顯著的臨床治療效果,但在癲癇發病人群中仍有30%～40%的患者不能獲得滿意治療療效,這種則屬于難治性癲癇,難治性癲癇有其自身的復雜性,且對多種藥物有耐藥性。在手術治療上,很多難治性癲癇患者往往因為神經功能損害而不適合致癲癇病灶的切除。

VNS是臨床中第一個被批準使用的刺激性治療方法,這種治療手段主要是針對不能進行外科手術治療的難治性癲癇患者而推出的輔助治療方案。VNS治療的原理是通過外科手術將螺旋電極纏繞于頸部迷走神經上,將可植入裝置置于胸前,然后調整相關參數模式,通電刺激迷走神經,最終達到治療目的〔9,10〕。有研究顯示,VNS可以對病灶進行精準定位在經電刺激后會降低癲癇發病次數,甚至可以完全控制病情〔11〕。分析VNS的具體作用機制,需要從迷走神經入手,迷走神經的傳出、傳入神經纖維主要廣泛分布于內臟與軀體中,這些神經纖維會投射到腦部各個部位,與內臟功能產生相關反射,而迷走神經這種網狀傳出、傳入神經系統最適合VNS的作用原理,VNS可在刺激中利用上行、下行網狀神經系統控制脊髓,進而調節大腦皮質的相關功能〔12〕。

相關研究顯示,有超過70%的藥物難治性癲癇患者在手術治療時被發現其海馬出現萎縮、硬化現象,難治性癲癇的反復發作則是造成海馬硬化萎縮的主要原因,而反過來海馬萎縮又會讓癲癇發作次數增多,形成一種惡性循環〔13,14〕。本研究結果說明,VNS可以讓難治性癲癇大鼠海馬組織CA3區受損狀態得到改善,內皮細胞、核仁、微血管等都處于恢復狀態,提示VNS會減輕難治性癲癇造成的海馬組織損傷。

本研究說明,VNS治療會有效控制難治性癲癇的發作,減少海馬神經元的凋亡、壞死,進而保護海馬神經元,這一點或許就是VNS抗癲癇的作用機制,VNS與海馬神經元之間的調節機制還需進一步研究。既往研究表明,MCP-1、LAP、P-gp等相關蛋白都與難治性癲癇的耐藥性有緊密聯系〔15,16〕。本研究結果提示,海馬區MCP-1、LAP、P-gp蛋白與耐藥基因有密切關系,可作為非藥物作用的治療靶點,是VNS治療的新作用途徑。

HMGB1會作為損傷相關分子模式參與多種疾病的發病中,經常參與機體耐藥及炎癥的修復過程中。HMGB1在多項動物癲癇模型實驗中都有較高的蛋白表達,研究人員證實了HMGB1是通過介導炎癥來激活癲癇病灶組織,進而促進癲癇的發生、發展〔17～19〕。TLR4會參與機體免疫應答反應,相關研究已經證實,TLR4在腦中的表達范圍僅存在于突膠質細胞、星形膠質細胞及小膠質細胞中,在中樞神經系統結構中也有一定表達,其在這些組織中的高表達會加速神經元死亡〔20,21〕。本研究結果顯示,提示HMGB1/TLR4通路的活化是癲癇發生、發展的重要原因,且與癲癇的耐藥性有關,據此可以推測,VNS可能通過HMGB1/TLR4信號通路,逆轉了相關耐藥基因,比如MCP-1、LAP、P-gp過度表達而發揮調節作用,讓神經功能趨于平衡狀態,抑制癲癇發作。