外源性H2S對血管性癡呆大鼠缺血再灌注后神經元線粒體損傷及其相關信號通路的影響

劉雨霞 肖子宇 鄭菊 張文萍 齊曉嵐 吳昌學 李毅 官志忠 肖雁

(地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室 貴州醫科大學,貴州 貴陽 550004)

血管性癡呆(VaD)是指各種腦血管疾病引起腦功能障礙而造成的后天性智能障礙綜合征,其作為最常見的老年期癡呆之一,患病人數占所有老年癡呆人數的15%〔1〕,屬于血管性認知障礙(VCI)的一類,發病后嚴重影響患者生活質量〔2,3〕。高血壓、動脈硬化、冠心病和糖尿病等多種疾病均可引起腦血管不同程度的狹窄、閉塞等病理改變,使海馬等參與認知功能的重要部位處于缺血缺氧低灌注狀態,導致VaD的發生〔4〕。線粒體是胞內能量產生的場所,常被稱為“細胞的動力工廠”,是缺血再灌注所致神經元損傷的靶點。在VaD大鼠海馬中觀察到神經元線粒體損傷,推測線粒體損傷與缺血再灌注后學習記憶功能障礙有關〔5〕。硫化氫(H2S)可以通過減少神經細胞凋亡而起到腦保護作用,在缺血再灌注損傷中的作用受到關注〔6,7〕。本課題組前期用H2S供體硫氫化鈉(NaSH)處理VaD模型大鼠,發現外源性H2S可以通過減輕神經元細胞凋亡改善VaD大鼠的學習認知能力及病理變化〔8〕。本研究利用改良二血管法(2-VO)結扎SD大鼠雙側頸總動脈制作VaD模型,使用NaSH作為H2S供體,探討外源性H2S對VaD大鼠海馬神經元線粒體功能與線粒體自噬及其相關信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1動物 成年健康雄性SD大鼠,體質量220～250 g,購自貴州醫科大學動物實驗中心,合同號:SCKY(黔)2018-0001。所有實驗操作獲得貴州醫科大學動物倫理委員會的許可。

1.2主要試劑及抗體 Tris、甘氨酸、氯化鈉(NaCl)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、Tween-20、苯甲基磺酰氟(PMSF)、脫脂奶粉均購自北京Solarbio有限公司,二甲亞砜(DMSO)、NaSH均購自美國Sigma公司;DMEM/F12(1∶1)完全培養基、無糖DMEM、澳洲胎牛血清均購自美國Gibco公司;0.25%胰酶消化液、雙抗、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑、電化學發光(ECL)-Plus液購于美國Thermo Fisher Scientific公司;組織線粒體分離試劑盒、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)快速凝膠配制試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、一抗稀釋液、二抗稀釋液、一抗二抗去除液均購于碧云天生物技術公司;預染Marker購自愛必信生物有限公司,聚偏氟乙烯(PVDF)膜購于美國Millipore公司?？贵w:Beclin1 抗體(ab217179)、SQSTM1/P62抗體(ab91526)均購自美國Abcam公司;COX Ⅳ(#4850)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR,#2983)、P-mTOR(#5536)、蛋白激酶B(Akt,#4691)、P-Akt(#4060)、辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗兔二抗(#7074)均購自美國CST公司;Anti-beta actin(abs830031)購于上海愛必信公司。

1.3動物篩選及分組 雄性SD大鼠210只。保持室溫25 ℃,清潔環境下以純凈水、標準飼料適應性喂養30 d后進行Morris水迷宮實驗,檢測其學習記憶能力,1～4 d對大鼠的定航能力及學習能力進行檢測:按照相同順序分別將四個象限中點作為大鼠入水點,使其面向池壁放入水中,進行自由探索,若60 s內找到平臺即結束實驗,若未找到則引導其站至平臺上并停留10 s結束實驗。第5天檢測其學習記憶能力:開始撤除平臺,仍將各象限中點作為其入水點,使其自由探索,并記錄其在60 s內第一次游經平臺原位置所需時間(即逃避潛伏期)及60 s內大鼠穿越平臺目標區域次數、目標象限內停留時間。選取時間、記憶力相近的SD大鼠180只,按缺血進程的急性缺血期、缺血損傷期、損傷恢復期,利用隨機數字表法隨機分為1、7、30 d 3個時間段,每個時間段各設置假手術(Sham)組、模型(VaD)組、陽性對照〔尼莫地平(Nimodipine)〕組、NaSH低劑量(Low-NaSH)組、NaSH高劑量(High-NaSH)組,每組12只。

1.4VaD大鼠模型制備 大鼠術前10 h禁食禁水。按照0.3 ml/100 g體質量的劑量經腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉后仰臥位固定,頸部備皮,碘伏,75%酒精常規消毒,頸前正中線切口,分離暴露雙側頸總動脈,Sham組僅進行分離操作不進行結扎,其他各組均使用手術線永久結扎雙側頸總動脈,傷口噴灑使用青霉素粉預防傷口感染,縫合皮膚并作常規消毒。常規飲食清潔飼養。

1.5SD大鼠給藥 為保持藥物處理時間一致,1、7 d各組術前灌胃給藥30 d,30 d各組術后灌胃給藥30 d,Nimodipine組10 mg/(kg·d)Nimodipine灌胃給藥、Low-NaSH組及High-NaSH組分別灌胃30、100 μmol/kg NaSH,VaD組和Sham組用等量生理鹽水灌胃。

1.6行為學實驗 給藥結束后利用Morris水迷宮實驗對30 d各組學習記憶能力進行檢測,方法同1.3。

1.7樣本制備 水迷宮測試結束后進行取材。稱重后腹腔注射10%水合氯醛(0.45 ml/100 g),麻醉后用1×磷酸鹽緩沖液(PBS)心臟灌注取腦,冰上分離海馬組織,用組織線粒體分離試劑盒提取海馬線粒體,部分于-80 ℃凍存。

1.8Western印跡法檢測相關蛋白的表達 BCA蛋白定量法于570 nm波長檢測吸光度從而測定胞漿蛋白濃度,以12 μl/20 μg體系每孔上樣于12%的SDS-PAGE凝膠,30 mA恒流進行電泳分離,200 mA轉膜75 min,一抗孵育(Akt、P-Akt、mTOR、P-mTOR、P62、Beclin1、COXⅣ用一抗稀釋液稀釋1 000倍,actin用一抗稀釋液稀釋3 000倍),兔二抗稀釋5 000倍進行二抗孵育,化學發光成像儀成像。用ImageJ分析曝光圖片中各條帶灰度值,計算結果時,以COXⅣ條帶灰度值作為內參,計算P62、Beclin1蛋白條帶灰度值與COXⅣ條帶灰度值的比值表示P62、Beclin1蛋白表達量相對水平;以actin作為參照,計算P-Akt、P-mTOR蛋白條帶灰度值與Akt、mTOR條帶灰度值的比值表示P-Akt、P-mTOR蛋白表達量相對水平

1.9統計學分析 采用SPSS20軟件進行單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1行為學結果 Sham組逃避潛伏期隨時間增加而縮短;VaD組逃避潛伏期較Sham組長且隨時間變化不明顯;第三天后,Nimodipine、Low-NaSH、High-NaSH組逃避潛伏期較VaD組短,但Low-NaSH組逃避潛伏期比Nimodipine組和High-NaSH組更長。在第五天空間探索實驗中,與Sham組比較,VaD組逃避潛伏期延長、穿越平臺次數減少、目標區域時間降低,差異有統計學意義(均P<0.01),表明大鼠2-VO術后30 d學習記憶能力及定航能力受到損傷;與VaD組比較,Nimodipine組及NaSH不同劑量組逃避潛伏期降低、穿越平臺次數增加、目標區域時間延長,差異有統計學意義(均P<0.01);與Low-NaSH組比較,High-NaSH組逃避潛伏期較短、穿越平臺次數較多、目標區域時間較長,差異有統計學意義(均P<0.01)。見表1。

表1 各組Morris水迷宮不同時間逃避潛伏期及Morris水迷宮第五天學習記憶能力比較

2.2各組海馬神經元細胞內自噬蛋白Beclin1表達 術后1 d,與Sham組比較,VaD組Beclin1表達顯著降低;與VaD組比較,不同劑量NaSH組Beclin1表達顯著降低(均P<0.05)。術后7、30 d,與Sham組比較,VaD組Beclin1表達顯著升高;與VaD組比較,Nimodipine組及不同劑量NaSH組Beclin1表達顯著降低;與Low-NaSH組比較,High-NaSH組Beclin1表達顯著降低(P<0.05,P<0.01)。見圖1、表2。

1～5:Sham組、VaD組、Nimodipine組、Low-NaSH組、High-NaSH組;下圖同圖1 Western印跡檢測各組Beclin1、P62表達水平

2.3各組海馬神經元細胞內自噬蛋白P62表達 術后1 d,各組P62蛋白表達無統計學差異(P>0.05)。術后7 d,與Sham組比較,VaD組P62表達顯著降低;與VaD組比較,Nimodipine組及不同劑量NaSH組P62表達顯著升高(均P<0.01)。術后30 d,與Sham組比較,VaD組P62表達顯著升高;與VaD組比較,Nimodipine組及不同劑量NaSH組P62表達顯著降低;與Low-NaSH組比較,High-NaSH組P62表達顯著降低(均P<0.01)。見表2、圖2。

2.4各組海馬神經元細胞內自噬通路蛋白P-Akt表達 術后1 d,與Sham組比較,VaD組P-Akt表達顯著降低;與VaD組比較,Nimodipine組及不同劑量NaSH組P-Akt表達顯著降低;與Low-NaSH組比較,High-NaSH組P-Akt表達顯著降低(均P<0.01)。術后7 d,與Sham組比較,VaD組P-Akt表達顯著降低;與VaD組比較,不同劑量NaSH組P-Akt表達顯著升高(均P<0.01)。術后30 d,與Sham組比較,VaD組P-Akt表達顯著降低;與VaD組比較,Nimodipine組及不同劑量NaSH組P-Akt表達顯著升高;與Low-NaSH組比較,High-NaSH組P-Akt表達顯著升高(P<0.05,P<0.01)。見表2、圖2。

2.5各組海馬神經元細胞內自噬通路蛋白P-mTOR表達 術后1 d,與Sham組比較,VaD組P-mTOR表達顯著降低;與VaD組及Low-NaSH組比較,High-NaSH組P-mTOR表達顯著降低(P<0.05,P<0.01)。術后7 d,與Sham組比較,VaD組P-mTOR表達顯著降低;與VaD組比較,High-NaSH組P-mTOR表達顯著升高(P<0.05,P<0.01)。術后30 d,與Sham組比較,VaD組P-mTOR表達顯著降低;與VaD組比較,Nimodipine組及不同劑量NaSH組P-mTOR表達顯著升高;與Low-NaSH組比較,High-NaSH組P-mTOR表達顯著升高(P<0.05,P<0.01)。見表2、圖2。

表2 各組海馬神經元線粒體中Beclin1、P62及胞質中P-Akt、P-mTOR表達水平比較

圖2 Western印跡檢測各組P-Akt、P-mTOR表達水平

3 討 論

VaD被廣泛認為是除阿爾茨海默病(AD)后第二種最常見的癡呆類型,其臨床表現主要有神經認知障礙,還包括行為癥狀,運動異常等。缺血后慢性低灌注也是VaD的常見誘因之一,腦卒中后慢性低灌注導致腦血流量(CBF)降低,缺氧導致氧化應激并且引發炎癥反應,氧化應激使血管內皮細胞、膠質細胞和神經細胞受損從而導致CBF進一步降低,這些病理變化發生在大腦并導致VaD〔9〕。2-VO法可導致大鼠皮質區域整個CBF突然減少至35%～45%,并導致海馬中CBF減少至60%〔10～12〕,能很好模擬人類衰老和癡呆中發生的全腦慢性低灌注。

線粒體是一種重要的細胞器,在活細胞中主要負責能量代謝和氧自由基(ROS)生成,同時也是缺血再灌注損傷的靶細胞器〔13〕,腦卒中后慢性低灌注可引發神經系統中神經元細胞內線粒體發生功能障礙〔14〕。自噬是介導功能障礙線粒體去除的關鍵細胞機制之一。本研究結果說明,在急性缺血期線粒體發生功能障礙,可能是線粒體自噬還未被激活,術后7 d及30 d線粒體自噬程度隨術后時間延長而增加,且術后7 d時P62表達量降低,可能是因為此時已經過了急性缺血期(1 d),并且在缺血損傷期線粒體自噬處于穩定狀態,P62募集水平小于其降解水平。而術后30 d時P62表達量與Beclin1同步升高,可能是因為在損傷修復期線粒體自噬程度升高,也可能與損傷后自我修復過程中線粒體自噬流受到抑制有關。推測在某一時間段內,神經細胞中線粒體自噬程度隨缺血再灌注時間延長而加深,而缺血時間超過機體限度時再灌注會誘發細胞死亡。其中具體機制可能與缺血再灌注過程中線粒體功能、線粒體自噬及細胞存活之間的調控有關。

研究表明,H2S是一種新型氣體遞質,類似于一氧化氮和一氧化碳,通過抗炎癥〔15〕和抗氧化應激對心腦血管起保護作用〔16〕。有研究指出,H2S對腦缺血小鼠的血腦屏障完整性起著重要的保護作用〔17〕。此外,有研究證明H2S對氧糖剝奪再灌注(OGD/R)誘導的神經元細胞凋亡中線粒體功能起到保護作用〔18〕。同時有研究表明,H2S與自噬有關,H2S通過調節磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt1通路抑制心肌纖維化的自噬〔19〕。課題組前期研究發現VaD大鼠血漿H2S含量降低、學習記憶能力受損,NaSH處理后血漿H2S含量升高且學習記憶能力增強〔8〕,而H2S改善VaD大鼠學習記憶能力的作用機制目前尚不明確。同時,H2S對于腦缺血再灌注損傷中線粒體自噬的作用尚無定論,但有研究認為當自噬在疾病的發病機制中發揮正面作用時,外源性H2S處理可使自噬上調,當自噬發揮負面作用時,外源性H2S通過下調自噬發揮保護作用〔20〕。本研究結果說明,外源性H2S作為預防藥處理后大鼠海馬神經元線粒體自噬程度降低,并且缺血再灌注7 d大鼠海馬神經元線粒體自噬流被抑制:而作為治療藥物處理,同樣能使缺血再灌注30 d VaD大鼠海馬神經元線粒體自噬程度降低。此前有研究通過抑制人神經元細胞母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)細胞內線粒體鈣單向轉運蛋白降低了OGD/R后的線粒體自噬,并且改善了線粒體形態及功能,提高了細胞活力〔21〕。推測在VaD大鼠海馬神經元細胞中,缺血再灌注導致的線粒體自噬過量,在VaD發病中起負面作用,而H2S通過降低海馬神經元中線粒體自噬水平起到神經元保護作用。本研究說明,高劑量NaSH能更好降低缺血再灌注后神經細胞線粒體自噬程度,能較好改善VaD大鼠腦組織中神經元線粒體功能障礙,從而對VaD大鼠發揮更強的神經保護作用。

PI3K/Akt/mTOR信號通路是一種重要的信號傳導介質,對損傷后神經元存活產生顯著影響。通常被視為關鍵神經保護信號通路之一〔22〕。PI3K是一種細胞內磷脂酰肌醇激酶,通過調節其下游信號通路在腦缺氧缺血性損傷中發揮核心作用,而Akt作為關鍵信息分子,是PI3K 信號轉導通路中的重要下游靶點?？纱碳ぜ毎婊?、增殖、抑制細胞凋亡,維持正常功能。同時,作為Akt重要底物之一,mTOR是細胞存活、增殖、分化和代謝的主要調節因子,并且P-mTOR活性升高可抑制自噬〔23〕。研究證實,經過缺血再灌注損傷后的神經細胞中P-PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白表達受到抑制。同時,Akt/mTOR通路與線粒體自噬呈負調控關系。外源性H2S可通過PI3K/Akt/mTOR途徑抑制自噬從而改善脂多糖誘導的急性肺損傷〔24〕。本研究發現,外源性H2S可減輕腦缺血再灌注損傷后的線粒體自噬,術后7 d及30 d模型組Akt/mTOR通路均受到抑制,但NaSH處理后Akt/mTOR通路被激活且線粒體自噬受到抑制,同時30 d NaSH高劑量處理組P-mTOR、P-Akt表達量較NaSH低劑量明顯升高,與30 d組線粒體自噬程度呈負相關,推測外源性H2S可通過上調Akt/mTOR通路抑制神經元線粒體自噬并改善其線粒體形態及功能,從而保護神經細胞免受缺血再灌注損傷。此前Xu等〔25〕發現,NaSH可通過激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制線粒體自噬改善線粒體功能,并起到改善腦應激性損傷后的功能恢復作用。本研究結果提示,OGD/R在1 d后Akt/mTOR通路受到抑制,用陽性藥物及NaSH處理后P-Akt與P-mTOR表達量與模型組比較均降低,說明NaSH處理后Akt/mTOR通路進一步受到抑制,但是觀察到線粒體自噬程度卻也降低,說明Akt/mTOR通路與線粒體自噬調節不是一個專一性調控,可能還有其他通路參與外源性H2S對腦缺血再灌注過程中的線粒體自噬的調控。

綜上,缺血再灌注會導致神經元線粒體功能受損并激活胞內線粒體自噬,在缺血急性期線粒體損傷嚴重但無明顯線粒體自噬發生,同時在一定時間段內隨著缺血時間增加,線粒體自噬程度增強。外源性H2S可保護缺血再灌注所致神經元線粒體功能受損,降低VaD大鼠海馬神經元的線粒體自噬程度,從而對神經元發揮保護作用,Akt/mTOR通路在其中起到調控作用。且高劑量NaSH處理比低劑量 NaSH處理能更好改善VaD大鼠腦組織中神經元線粒體功能障礙、降低神經元線粒體自噬程度,對學習、記憶及定航能力有更好的改善作用。