β2腎上腺素能受體激動劑對低氧誘導肺動脈高壓中肺血管重構及BMPR2/BMP4表達的影響

陳祖喬 王芳 李澤罡 尹濤源

(1三亞中心醫院心內科, 海南 三亞 572000;2海南醫學院基礎醫學與生命科學學院)

肺動脈高壓(PAH)是一種具有高致死率的進行性肺血管疾病,其特征是肺動脈血管重構和肺血管阻力增加,最終導致右側心室肥大和心力衰竭,甚至引起患者死亡〔1,2〕。其中,肺血管重構在PAH的發生發展過程中起著重要作用,主要表現為內側增厚、肺動脈肌肉增強及肺動脈平滑肌細胞不受控制的增殖擴張〔3〕。近年來,盡管PAH的治療取得了進展,主要通過使用包括內皮素受體拮抗劑、磷酸二酯酶抑制劑和前列環素類似物等對肺血管進行收縮以改善PAH癥狀〔4〕,但這種方法只能適度提高患者生存率,多數患者的預后仍然較差。因此,如何有效防治PAH現已成為臨床上亟待研究并解決的一項關鍵內容。β腎上腺素能受體(βAR)是G蛋白耦聯受體的一種,可作為正常生理條件下心肌收縮力調節的關鍵因子。β2AR是G蛋白耦聯受體超家族的一員,廣泛表達于平滑肌上,如血管平滑肌、支氣管平滑肌、骨骼肌血管等,該受體與其激動藥劑結合后可引起平滑肌舒張〔5〕。研究表明,在某些類型導致的心力衰竭中,β2AR丟失可能會失去正常的心臟保護特性〔6〕。此外,有報道指出β2AR受體激動劑對慢性阻塞性肺疾病患者的肺循環血流動力學和右室功能表現出有益作用,能夠延緩疾病的發生和發展〔7〕。鑒于此,本研究通過低氧誘導構建大鼠PAH模型,以沙丁氨醇作為β2AR激動劑對PAH大鼠進行治療,旨在探討β2AR激動劑在PAH大鼠肺血管重塑中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級健康Sprague-Dawley大鼠40只,雄性,體質量180～200 g,由海南藥物研究所有限責任公司提供,飼養于無特定病原體屏障環境,溫度22～24 ℃,相對濕度為(50±5)%,12 h/12 h明暗交替,適應性喂養1 w后進行實驗。本研究獲得醫院倫理委員會審批。

1.2主要試劑 β2AR激動劑沙丁氨醇(齊魯制藥),蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒和丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒(南京建成生物公司),免疫熒光染色試劑盒和免疫組織化學染色試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司),二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒和增強型電化學發光(ECL)顯色液(上海碧云天生物研究所),兔抗人肺組織增殖細胞核抗原(PCNA)多克隆抗體、鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白(SMA)單克隆抗體、兔抗人骨形態發生蛋白(BMP)4多克隆抗體、兔抗人BMP受體(BMPR)2多克隆抗體和兔抗人Smad1/5/8多克隆抗體(英國Abcam公司),兔抗人磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物公司)。

1.3低氧誘導PAH模型的建立及分組 將40只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、β2AR激動劑低劑量組、β2AR激動劑高劑量組,每組10只。對照組飼養于常氧環境下,其余3組飼養于常壓低氧箱內,氧濃度設置為(10.0±0.5)%,箱內放石灰鈉和無水氯化鈣,用以吸收過量的CO2和水分,連續3 w后,β2AR激動劑低、高劑量組分別通過腹腔注射2.5、5.0 mg/kg的沙丁氨醇,其他兩組同時腹腔注射等體積磷酸鹽緩沖液(PBS),1次/d。連續2 w,期間各組均自由進食、飲水。

1.4肺動脈壓的測量 給藥結束后,腹腔注射10%水合氯醛注射液麻醉,以仰臥位固定于解剖臺上,皮膚消毒,將導管經右頸外靜脈插入,經右心房送入右心室(RV),固定導管,另一端導管與Power Lab電力生理信號數據采集系統連接,記錄儀上觀察右心室內壓力波形,記錄RV收縮壓(RVSP)。

1.5RV肥厚指數的測量 RVSP測量結束后,預冷PBS灌流,迅速離體肺組織及心臟,分別分離RV、左心室(LV)及室間隔(S),電子分析天平稱重,計算RV肥厚指數(RVH),公式:RVH=RV/(LV+S)。

1.6HE染色觀察肺組織重構 將左側肺組織置于4%甲醛溶液固定24 h,常規石蠟包埋,切片機上進行連續切片,制備成厚度為5 μm的組織切片。取組織切片,經過二甲苯脫蠟和梯度酒精脫水,雙蒸水洗滌,Mayer蘇木素染色10 min,雙蒸水洗滌,1%鹽酸-酒精分化數秒,流水沖洗,再用雙蒸水洗滌,0.5%伊紅染色2 min,流水沖洗,程序化脫水與透明,中性樹膠封固,在光學顯微鏡下觀察肺組織形態學變化與重構,并攝取圖像。

1.7肺組織內氧化應激相關指標的測定 將右側肺組織用預冷生理鹽水沖洗干凈,無菌環境下剪碎,稱取適量于離心管,加入適量RIPA裂解液,超聲波細胞破碎儀充分磨碎,冰上靜置10 min充分裂解,4 ℃低溫離心機以12 000 r/min離心10 min,留取上清液,通過氮藍四唑顯色法檢測SOD活性,硫代巴比妥酸法測定MDA含量,參照試劑盒說明操作。

1.8免疫熒光染色法檢測肺組織PCNA表達 取制備的肺組織切片,經過二甲苯脫蠟和梯度酒精脫水后,PBS洗滌(5 min×3次,下同),微波爐高溫(95 ℃)修復抗原,室溫冷卻后,以10%山羊血清室溫封閉45 min,棄去多余血清,在切片上滴加經PBS稀釋的兔抗人PCNA多克隆抗體(1∶100),4 ℃下孵育過夜。次日,PBS洗滌,滴加經PBS稀釋的熒光素標記的二抗(1∶200),室溫避光孵育2 h,PBS沖洗后,4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)避光孵育15 min,防淬滅封片劑封片,熒光顯微鏡觀察熒光表達強度變化,并攝取圖像。

1.9免疫組織化學染色測定肺組織α-SMA表達 取制備的肺組織切片,經過二甲苯脫蠟和梯度酒精脫水后,3%H2O2抑制內源性過氧化物酶室溫處理20 min,PBS清洗后,用10%山羊血清室溫封閉1 h,將切片與經PBS稀釋后的鼠抗人α-SMA單克隆抗體(1∶100)置于4 ℃下共孵育過夜。次日,PBS洗滌,切片上滴加經PBS稀釋的酶標記的二抗(1∶1 000),室溫孵育1 h,PBS洗滌。利用DAB試劑液顯色,流水沖洗,蘇木素復染,程序化脫水與透明,中性樹膠封固,在光學顯微鏡下觀察肺組織切片內染色情況,并攝取圖像,陽性著色為胞質或胞核呈棕黃色至棕褐色,每張切片隨機選擇5個不同視野,Image-Pro Plus6.0軟件統計陽性染色的平均光密度值。

1.10Western印跡檢測肺組織BMP4/BMPR2途徑相關蛋白表達 取右側肺組織研磨勻漿后,提取蛋白,BCA法測定蛋白濃度,使用裂解液將各樣品濃度進行歸一化處理。制備10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠,取50 μg蛋白上樣,進行凝膠電泳分離蛋白,再以200 mA恒流轉膜,將分離的目的蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,將膜與5%脫脂奶粉封閉液共封閉1 h,再分別浸于PBS稀釋的一抗液(1∶1 000)中,4 ℃孵育過夜。次日,Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)洗膜(10 min×3次,下同),常溫下將膜與經PBS稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)共同孵育 1 h,TBST再洗膜。利用增強型ECL顯色液在暗箱內進行顯影,凝膠成像系統拍攝圖像,Image-Pro Plus6.0軟件分析各目的蛋白及內參蛋白GAPDH的灰度值,以目的蛋白與內參蛋白的灰度值比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.11統計學分析 采用GraphPad8.30軟件進行單因素方差分析和LSD法檢驗。

2 結 果

2.1各組肺動脈壓力及RVH對比 與對照組比較,模型組RVSP和RVH顯著增加(P<0.05)。與模型組比較,β2AR激動劑低、高劑量組RVSP和RVH均顯著降低(P<0.05)。而β2AR激動劑低、高劑量組RVSP和RVH差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

2.2各組肺組織HE染色 對照組肺組織結構完整,管壁周圍未見明顯的炎癥細胞浸潤;與對照組比較,模型組肺小動脈變窄,管壁增厚,內膜增生,重構現象明顯;與模型組比較,β2AR激動劑低、高劑量組肺組織病理改變明顯減輕,肺動脈壁增厚現象得到抑制,見圖1。

2.3各組肺組織SOD活性及MDA含量比較 與對照組比較,模型組肺組織中SOD活性顯著降低,MDA含量顯著增高(P<0.05);與模型組比較,β2AR激動劑低、高劑量組肺組織中SOD活性顯著升高,MDA含量顯著減少(P<0.05);β2AR激動劑低、高劑量組間SOD活性與MDA含量差異均無統計學意義(P>0.05),見表1。

2.4各組肺組織PCNA表達比較 各組免疫熒光染色結果顯示,對照組肺組織可見少量PCNA熒光表達,模型組肺組織中PCNA熒光表達強度明顯增加,β2AR激動劑低、高劑量組肺組織中PCNA熒光表達強度較模型組均明顯減弱,見圖2。

表1 各組RVSP、RVH、肺組織SOD活性與MDA含量、肺組織α-SMA陽性率及BMP4、BMPR2、p-smad1/5/8蛋白表達比較

圖1 各組肺組織(HE染色,×200)

箭頭所指為陽性表達圖2 各組肺組織PCNA表達(免疫熒光染色,×200)

2.5各組肺組織α-SMA表達比較 免疫組化染色結果顯示,對照組肺組織中著色細胞少,模型組肺組織著色細胞數明顯增加,α-SMA陽性率較對照組顯著升高(P<0.05);β2AR激動劑低、高劑量組肺組織中著色細胞數較少,α-SMA陽性率均較模型組顯著下降(P<0.05),見表1、圖3。

圖3 各組肺組織α-SMA表達(免疫組化染色,×400)

2.6各組肺組織BMP4/BMPR2途徑蛋白表達 Western印跡結果顯示,與對照組比較,模型組肺組織BMP4蛋白相對表達顯著上調,而BMPR2及smad1/5/8磷酸化蛋白表達顯著下降(P<0.05);與模型組比較,β2AR激動劑低、高劑量組肺組織BMP4蛋白相對表達顯著下調,BMPR2及smad1/5/8磷酸化蛋白表達顯著升高(P<0.05);與β2AR激動劑低劑量組比較,β2AR激動劑高劑量組BMP4蛋白相對表達顯著下調,BMPR2及smad1/5/8磷酸化蛋白表達顯著升高(P<0.05),見表1、圖4。

1～4:對照組、模型組、β2AR激動劑低劑量組、β2AR激動劑高劑量組圖4 各組肺組織BMP4/BMPR2途徑蛋白表達

3 討 論

PAH由各種病因引起肺血管結構和功能的改變,其病因復雜,臨床表現多樣。盡管目前在了解PAH的發病機制方面取得了重大進展,但尚未開發出有效的治療方法來逆轉肺血管重構、右心衰竭并提高PAH患者的生存率。目前的治療方法主要針對前列環素、一氧化氮和內皮素信號通路中的血管收縮異常,而對閉塞性血管重塑卻不能起到逆轉的作用〔4〕,因此,PAH的臨床研究旨在尋找改善不可逆肺動脈重塑的新療法。肺血管重構作為PAH的主要病理特征,包括肺動脈內皮細胞功能障礙、平滑肌細胞過度增殖及外膜成纖維細胞異常活化。而在長期慢性低氧環境下,缺氧誘導因子表達的提高引起了上述幾種細胞內血管活性因子、氣體信號分子及血管平滑肌內鈣離子濃度升高,進而誘發肺血管結構重構〔8〕。本研究發現,大鼠的RVSP和RVH均顯著升高,肺動脈結構發生重構,這表明PAH大鼠模型構建成功。

β2AR作為重要的G蛋白耦聯受體,其構象的活化或非活化狀態與哮喘、心血管疾病及一些自身免疫性疾病密切相關,刺激β2AR可同時激活促凋亡和抗凋亡信號途徑,在心力衰竭中促進心肌細胞的生存〔6〕,此外,還有報道指出使用β2AR激動劑非諾特羅能夠使高血壓心力衰竭大鼠的心功能得到恢復〔9〕。本研究結果顯示,經過β2AR激動劑治療后,PAH大鼠的肺組織病理改變明顯減輕,肺動脈壁增厚現象也受到了明顯抑制。大量研究表明,氧化應激在PAH中發揮著重要作用,SOD活性下降使得氧自由基清除能力降低,而MDA含量的增高促進了其與氧自由基的結合,提高了肺動脈平滑肌細胞的異常增殖水平,進而促進了肺血管重構〔10,11〕。本研究表明,β2AR激動劑能夠抑制低氧誘導的PAH大鼠肺組織SOD活性下降與MDA含量增高,減輕了PAH中氧化應激水平,從而起到治療PAH的作用。

肺動脈平滑肌細胞(PASMC)增生是肺血管重構的主要特征,也是PAH發生和發展的病理基礎。PASMC中增殖表型標記是PAH患者或PAH動物模型的關鍵特征〔12〕。本研究結果顯示,在PAH大鼠的肺組織中檢測到細胞增殖性標記PCNA蛋白表達顯著增加,再結合組織病理學染色觀察結果,即肺小動脈變窄及管壁增厚、內膜增生的現象,由此推測,PAH大鼠的肺組織中PASMC發生了異常增殖。PASMC具有極強的可塑性,可響應各種環境刺激而從收縮或靜止表型去分化為增殖或合成表型。PASMC 經歷從收縮到合成的表型轉換,這是伴隨細胞過度增殖和血管重塑的主要原因,通常情況下,表型轉換會限制一些收縮蛋白如α-SMA的表達〔13〕。本研究結果說明,β2AR激動劑可能抑制了PAH大鼠肺組織內PASMC的過度增殖,進而緩解了肺血管重構。

BMPR2及其相關信號通路是肺血管穩態的關鍵調節因子,據統計,大約有80%的家族性PAH患者和20%的特發性PAH患者攜帶BMPR2的雜合突變〔14〕。BMPR2基因突變也在其他因素引起的肺動脈高壓患者中發現,如先天性心臟病、肺靜脈阻塞等〔15,16〕,此外,BMPR2功能減退或喪失也有助于PAH發病機制。目前,越來越多的研究將功能失調的BMPR2相關信號傳導(包括 BMPR2、p-smad和BMP4)與PAH的過程發展聯系起來,而BMPR2基因的靶向遞送對PAH動物模型具有治療作用〔17〕。在缺氧條件下,缺氧誘導因子(HIF)-1α能夠誘導miR-322表達,而miR-322通過靶向BMPR1a和smad5來下調BMPR2信號途徑〔18〕。本研究檢測結果與先前報道一致,BMP4起初被鑒定為調節軟骨細胞生長和分化的分子,現已知其在包括PASMC在內的其他細胞中也能發揮調節生長、分化和凋亡的作用〔19〕。

綜上,β2AR激動劑對低氧誘導PAH大鼠具有保護作用,能夠減輕PAH中氧化應激水平,抑制BMP4表達而激活BMPR2及下游蛋白smad1/5/8表達,從而改善低氧誘導PAH 大鼠中肺血管重構。然而,在β2AR激動劑介導的低氧誘導PAH肺血管重構中,涉及相關細胞如PASMC增殖的分子機制還有待探索。