前列地爾聯合CRRT對急性腎衰竭患者腎血流及自噬相關蛋白的影響

劉靜梅 柴海霞 王會軍 王印華 郭煒妍

(1唐山市協和醫院,河北 唐山 063000;2華北理工大學附屬醫院;3唐山南湖醫院)

急性腎衰竭(ARF),又稱急性腎損傷(AKI),通常發生在病危的住院患者身上〔1～3〕。當腎臟停止運作時,原本要從血液中過濾掉的尿素、肌酐和其他物質開始積聚進而引發排尿減少、惡心、疲勞、呼吸急促和由于液體滯留而腫脹甚至危及生命等的一系列癥狀。ARF的發病原因大致分為腎前性(由流向兩個腎臟的血流量減少引起)、內在性(由腎臟損傷引起)或腎后性(最常見的是尿路梗阻)3種。ARF治療通常采用升壓藥物以幫助升高血壓、靜脈輸液以幫助補液、利尿劑以增加尿量及血液透析以幫助在腎臟愈合時過濾血液等多種策略〔4～6〕。連續性腎臟替代治療(CRRT)是目前臨床上常用的有效治療ARF的手段,能夠模擬腎臟的清除模式,緩慢且持續地清除炎性介質,療效確切,但費用較高〔7～9〕。前列地爾能夠改善腎血流動力學進而增加尿量和尿鈉排泄,同時有研究表明可以抑制細胞自噬,減輕組織損傷〔10,11〕。本研究探討前列地爾聯合CRRT對ARF患者腎血流及自噬相關蛋白表達的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年7月至2020年7月來唐山市協和醫院治療并且確診為ARF患者104例。納入標準:符合急性腎衰竭診斷標準〔12〕;近1個月無相關藥物治療史;非妊娠期或哺乳期婦女;排除標準:慢性腎功能不全基礎上的ARF;腎移植患者;臨終患者;心、肝、腎等內臟臟器功能異常;凝血功能受損;對治療藥物過敏者;合并惡性腫瘤、內科疾病、感染及其他自身免疫性疾病。患者隨機分為對照組和觀察組各52例,其中對照組男29例,女23例;平均年齡(44.1±5.9)歲;平均病程(12.5±1.5)d;平均急性生理與慢性健康評估(APACHE)Ⅱ評分(21.55±1.8)分,觀察組男25例,女27例;平均年齡(45.9±7.5)歲;平均病程(12.5±1.3)d;平均APACHEⅡ評分(21.61±1.7)分。兩組一般資料無明顯差異(P>0.05)。所有患者知曉該研究且簽署同意書,該方案通過醫院倫理委員會的批準。

1.2研究方法 兩組均積極控制原發病因,給予營養支持控制體內的水、電解質和酸堿平衡,并嚴格控制感染。對照組給予CRRT,采用Aquarius CRRT血液凈化機(美國Baxter公司),置換液采用前后稀釋輸入氯化鈉置換液的方法,患者血流量保持在150～250 ml/min,輸入速度保證在2 000～3 000 ml/h,每天8～12 h,使用肝素或者低分子肝素抗凝,出現出血傾向時選擇無肝素或體外肝素法,治療持續3～5 d。治療期間每日早晨采集患者空腹動脈血、外周靜脈血及尿液進行檢測。研究組在給予CRRT的基礎上靜脈滴注前列地爾注射液(商品名:凱時,生產企業:北京泰德制藥股份有限公司;批準文號:國藥準字H10980023,規格:1 ml∶5 μg),靜脈注射,1次/d,10 μg/次。兩組均連續治療7 d。

1.3腎功能指標 采集兩組治療前后空腹晨尿,采用散射比濁法檢測尿液中的尿β2-微球蛋白(MG),采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、尿腎損傷分子(Kim)-1,試劑盒來自美國R&D Systems公司,檢測設備選用多功能酶標儀(ELX800,美國伯騰公司)。采集兩組治療前后的空腹靜脈血,采用全自動生化分析儀(Indiko Plus,美國賽默飛世爾科技公司)檢測血尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)蛋白表達水平。

1.4腎血流指標 采用彩色多普勒超聲儀(DW-F5,大為醫療有限公司)檢測腎動脈內徑及主腎動脈收縮期最高流速(PSV)、舒張末期流速(EDV),計算腎血流阻力指數(RI)=(PSV-EDV)/PSV。

1.5炎癥因子指標 采用ELISA檢測患者治療前后空腹靜脈血白細胞介素(IL)-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α、單核細胞趨化蛋白(MCP)-1蛋白表達,試劑盒來自美國R&D Systems公司,檢測設備選用多功能酶標儀(ELX800,美國伯騰公司)。

1.6自噬相關蛋白指標 采用Western印跡檢測患者治療前和治療后自噬效應蛋白(Beclin)-1、微管相關蛋白1輕鏈(LC3)-Ⅱ和自噬相關蛋白(Atg)5在單核細胞中的表達水平。分別于治療前和治療后抽取患者空腹靜脈血于肝素抗凝管中,加入Ficoll淋巴細胞分離液,12 000 r/min離心20 min,將離心后的交界面處的單核細胞收集到0.5 ml的離心管中,儲存于-80 ℃冰箱中。冷凍后向其中加入Trizol溶液(美國Thermo Fisher Scientific公司)按照使用說明提取單核細胞的mRNA,隨后采用PrimeScriptTMRT Master Mix(日本TaKaRa Bio公司)將其逆轉錄成cDNA。經電泳、轉膜、封閉。用相應的Beclin-1、LC3-Ⅱ和Atg5一抗按比例稀釋后4 ℃孵育過夜,將稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗與膜孵育1 h。用電化學發光(ECL)試劑盒顯影,用Quantity One專業灰度分析軟件分析條帶灰度值。以Beclin-1、LC3-Ⅱ和Atg5與β-actin的灰度值比值確定蛋白表達的相對水平。

1.7統計學方法 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1兩組臨床療效比較 治療后,對照組半年死亡率(46.15%,痊愈4例,好轉13例,無效11例,死亡24例)與觀察組(36.54%,痊愈6例,好轉18例,無效9例,死亡19例)無明顯差別(χ2=0.991,P=0.319)。

2.2兩組腎功能指標比較 治療前,兩組腎功能指標β2-MG、NAG、Kim-1、BUN、Scr水平均無統計學差異(P>0.05)。治療后,兩組β2-MG、NAG、Kim-1、BUN、Scr水平較治療前均顯著降低,且觀察組水平明顯低于對照組(均P<0.001)。見表1。

表1 兩組腎功能指標比較

2.3兩組腎血流指標比較 治療前,兩組腎動脈內徑和腎血流阻力指數比較無明顯差異(P>0.05)。治療后,兩組腎動脈內徑均顯著增大,腎血流阻力指數均明顯下降,且觀察組比對照組水平變化更明顯(P<0.01,P<0.001)。見表2。

2.4兩組炎癥因子指標比較 治療前,兩組炎癥因子IL-6、IL-10、TNF-α和MCP-1表達水平比較無明顯差異(P>0.05)。治療后,兩組炎癥因子水平均顯著下降,且觀察組比對照組降低程度更大(均P<0.001)。見表2。

2.5兩組自噬相關蛋白指標比較 治療前,兩組自噬相關蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ和Atg5 mRNA表達水平比較無明顯差異(P>0.05)。治療后,兩組自噬相關蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ、Atg5 mRNA表達水平均顯著下降,且觀察組比對照組降低程度更大(均P<0.001)。見表3。

表2 兩組腎血流指標及炎癥因子比較

表3 兩組自噬相關蛋白相對mRNA水平比較

3 討 論

ARF具有較高的發病率和死亡風險。在ARF中,腎小球濾過率在數天至數周內急速下降,含氮廢物的排泄減少,機體無法維持體液和電解質平衡,進而引發各臟器并發癥甚至導致死亡〔13,14〕。ARF造成的死亡最常由感染或心肺并發癥引起,根據腎衰竭的嚴重程度,死亡率可以從7%到高達80%。由于ARF患者通常年齡較大且并發癥更多,在過去的40年中其生存率并沒有提高。ARF患者通常無癥狀,可通過觀察血尿素氮和血清肌酐水平的急劇升高來診斷病情〔15,16〕。

目前,臨床上治療ARF危重患者多采用多種腎臟支持方式,包括CRRT、常規間歇性血液透析(IHD)和延長的間歇性腎臟替代療法(PIRRT)等,其中CRRT通過最大程度模擬腎臟的清除模式,能夠穩定腎血流動力學,緩慢且持續地清除溶質及炎性介質,且研究表明其治療效果與APACHEⅡ評分和炎癥因子水平等因素有關〔17,18〕。已有研究表明,給ARF患者輸注前列地爾可以改善腎血流動力學進而增加尿量和尿鈉排泄。自噬是一種通過將受損蛋白質、長壽命蛋白質、蛋白質復合物和細胞器動員到溶酶體從而維持細胞穩態的自噬分解代謝過程〔19,20〕。研究表明,在急性腎損傷時自噬體可以通過提高反應性對腎臟起到保護作用,同時在恢復期通過促進細胞增殖對腎小管起到再生和修復作用。而Beclin-1、LC3-Ⅱ和Atg5等自噬相關蛋白反映了自噬體的反應性,當自噬相關蛋白表達水平提高時,表明細胞自噬增強〔21～23〕。

本研究結果說明,前列地爾聯合CRRT對于腎功能的改善更加顯著,前列地爾聯合CRRT極大地改善了腎血流動力學。是因為前列地爾作為前列腺素 E1激動劑能夠通過對腎血管和動脈導管平滑肌的直接作用促進血管舒張,降低腎血管阻力。炎癥反應在ARF的病程發展中起到重要作用。本研究結果表明,在CRRT有效清除炎癥介質的基礎上前列地爾能夠進一步減輕腎臟炎性反應,緩解腎臟損傷;前列地爾的加入對于抑制ARF患者的細胞自噬起到了關鍵作用。本研究中前列地爾通過抑制細胞自噬改善腎功能,減輕腎組織損傷,其具體機制有待研究。