SOCS3基因甲基化狀態與真性紅細胞增多癥治療反應及預后的相關性

劉珊 李志賞 邢晶晶 王冬梅

(衡水市人民醫院血液科,河北 衡水 053000)

真性紅細胞增多癥(PV)是一組異質性、惡性造血干細胞克隆性疾病,發病率為每年2.3～2.8/萬人〔1〕。PV特征在于紅系造血干/祖細胞異?？寺≡鲋?臨床特征主要為血紅蛋白水平升高,疲勞、脾大等,易并發血栓或出血,骨髓纖維化和急性白血病轉化〔2〕。細胞因子信號傳導抑制因子(SOCS)3是促紅細胞生成素受體(EPOR)和細胞因子受體相關Janus 激酶(JAK)2 激酶信號通路的負調節因子,SOCS3基因功能改變影響細胞因子受體功能,減弱對JAK/信號轉導和轉錄激活因子(STAT)信號通路的抑制作用,導致腫瘤的發生和進展〔3〕?；蚣谆且环N表觀遺傳機制,通過阻止轉錄因子結合或促進甲基結合蛋白的結合調節基因轉錄,抑制或上調基因表達,現有研究顯示SOCS3甲基化與較低的SOCS3表達及骨髓增殖性腫瘤(MPN)發病之間存在關聯〔4〕。SOCS3甲基化是否影響羥基脲、干擾素治療PV的效果及預后尚不清楚。本研究擬檢測PV患者治療前后SOCS3甲基化狀態,分析其與PV羥基脲、干擾素治療反應及預后的關系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇2017年3月至2019年4月衡水市人民醫院血液科收治的109例老年PV患者(PV組),年齡63～78歲,平均(73.12±7.35)歲。白細胞計數(7～25)×109/L,平均(15.35±6.19)×109/L;血小板計數(352～504)×109/L,平均(472.35±20.19)×109/L;脾大56例,血栓栓塞63例,JAK2 V617F突變陽性91例。納入標準:①經骨髓細胞形態學、組織化學、免疫表型、融合基因、染色體等檢查確診PV,符合2016年世界衛生組織髓系腫瘤和急性白血病分類指南中PV的診斷標準〔5〕;②接受羥基脲聯合干擾素治療;③卡氏功能狀態(KPS)評分60分以上;④年齡60周歲以上,知曉本研究并自愿配合,簽署同意書。排除合并其他惡性腫瘤患者。另選擇30例于醫院門診體檢的健康志愿者為對照組,均經體檢中心系統檢查排除血液腫瘤及其他系統性疾病,男19例,女11例,年齡62～72歲,平均(72.98±6.85)歲。兩組性別和年齡比較差異無統計學意義(P>0.05),本研究已經獲得醫院倫理委員會批準。

1.2臨床治療和療效判斷 所有老年PV患者住院確診后給予羥基脲片(齊魯制藥有限公司,規格:500 mg/片)20 mg/(kg·d),分1～2次口服,定期檢測血常規,待血細胞接近正常時,聯合應用注射用重組人干擾素a-2b(上海萬興生物制藥有限公司,規格600萬IU)300萬 IU皮下注射,3次/w,根據患者外周血細胞計數調整干擾素及羥基脲劑量,使外周血三系細胞水平均穩定于大致正?；蜉p度異常范圍內,連續治療3個月。治療3個月后進行療效評估〔6〕:完全血液學緩解(CHR),血細胞比容<45%、白細胞<10×109/L、血小板≤400×109/L。達到CHR并且無重度癥狀定義為疾病充分控制,其他為疾病未充分控制。根據療效將患者分為控制組(48例)和未控制組(61例)。

1.3甲基化特異性實時定量聚合酶鏈反應(qMSP)檢測血清SOCS3基因甲基化表達 所有PV老年患者治療前及對照組體檢當日采集靜脈血3 ml,取血清樣本,采用Wizard?SV Genomic DNA Purification Kit組織DNA提取試劑盒(美國Promega生物公司)提取DNA,選取OD260∶OD280 1.8～2.0樣本(0.5 μg),采用MethylCodeTM亞硫酸氫鹽轉化試劑盒(美國Invitrogen公司)進行DNA硫酸氫鹽轉化,將提取的 DNA 中所有未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶,甲基化胞嘧啶不發生變化。以亞硫酸氫鹽修飾的DNA為模板,采用qMSP進行擴增,引物序列(上海捷瑞公司合成):SOCS3,上游:5′-CAGCTCCAAGAGCGAGTACCA-3′,下游,5′-AGAAGCCGCTC-TCCTGCAG-3′,GADPH(內參):5′-AATGGAAATCCCATCACCATCT-3′,下游:5′-CGCCCCACTTGATT-TTGG-3′。 反應體系,5 μl 2×SYBR Green Master Mix、0.25 μl 引物、4 μl雙蒸水(ddH2O)和 0.5 μl DNA。MSP條件:95 ℃ 下初始變性 10 min、95 ℃ 下變性 20 s、59 ℃ 下退火 30 s,72 ℃ 下延伸 30 s,共45個循環。PCR擴增后,LightCycler?480熒光定量PCR儀(德國Roche)檢測甲基化水平,采用甲基化參考的百分比量化甲基化水平,甲基化參考的百分比=2-(Ct 樣本-Ct內參) ×100%。

1.4隨訪 老年PV患者出院后均定期門診復查,不適隨診,門診復查內容包括血常規、血生化、凝血四項、骨髓細胞學檢查等。由血液科隨訪人員進行定期電話隨訪,每個月隨訪一次,隨訪時間截至2021年6月。綜合門診復查和隨訪結果統計無骨髓纖維化、白血病轉化生存時間,無骨髓纖維化生存時間定義為PV確診至骨髓纖維化發生、白血病轉化或隨訪截止時間。骨髓纖維化、白血病轉化參考2016年世界衛生組織髓系腫瘤和急性白血病分類指南中標準〔5〕診斷。

2 結 果

2.1PV組和對照組血清SOCS3基因甲基化表達差異 PV組血清SOCS3基因甲基化表達(5.23±1.02)顯著高于對照組(1.35±0.49;t=20.165,P<0.05)。

2.2不同臨床特征PV患者血清SOCS3基因甲基化表達差異 白細胞計數>10×109/L、血小板計數>450×109/L、血栓栓塞PV患者血清SOCS3基因甲基化表達顯著高于白細胞計數≤10×109/L、血小板計數≤450×109/L、無血栓栓塞PV患者(P<0.05),性別、脾大、JAK2 V617F突變陽性PV患者血清SOCS3基因甲基化表達比較差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

2.3不同治療反應性血清SOCS3基因甲基化表達差異 控制組血清SOCS3基因甲基化表達(4.49±0.22)顯著低于未控制組(5.81±0.43;t=19.355,P<0.05)。

2.4不同SOCS3基因甲基化表達PV老年患者無骨髓纖維化生存分析 中位隨訪32(14～51)個月,隨訪期間失訪6例,隨訪期間無死亡及發生白血病轉化病例,10例發生骨髓纖維化。根據SOCS3基因高甲基化表達均值,將PV老年患者分為SOCS3基因高甲基化組(>5.23,53例)、SOCS3基因低甲基化組(≤5.23,50例)。繪制Kaplan-Meier生存曲線,經分析顯示SOCS3基因高甲基化組無骨髓纖維化生存率(83.02%)顯著低于SOCS3基因低甲基化組(98.00%,Log-Rankχ2=6.664,P<0.05),見圖1。

表1 不同臨床特征SOCS3基因甲基化表達差異

2.5影響PV老年患者預后的Cox回歸分析 以老年PV患者隨訪期間是否發生骨髓纖維化為因變量(賦值:1=是,0=否),納入性別(0=女,1=男)、白細胞計數、血小板計數(0=≤450×109/L,1=>450×109/L)、脾大(1=是,0=否)、血栓栓塞、JAK2 V617F突變(1=是,0=否)、SOCS3基因甲基化表達為自變量。單因素Cox比例風險回歸分析結果白細胞計數、血栓栓塞、SOCS3基因甲基化表達是影響PV患者發生骨髓纖維化的因素(P<0.01)。多因素Cox比例風險回歸分析顯示血栓栓塞、SOCS3基因高甲基化是影響PV患者發生骨髓纖維化的因素危險因素(P<0.05),見表2。

圖1 不同SOCS3基因甲基化表達PV患者無骨髓纖維化生存曲線

表2 影響PV患者預后的單因素及多因素COX回歸分析

3 討 論

羥基脲是高危原發性血小板增多癥和PV患者的一線治療用藥,通過抑制細胞核及線粒體DNA復制,誘導細胞和線粒體障礙、外周血間充質干細胞衰老,抑制 JAK2V617F陽性人紅白血病細胞增殖〔7〕。但是羥基脲骨髓抑制作用強,患者耐受性差,停藥后易復發。干擾素可直接抑制造血干細胞增殖、破壞血小板和紅細胞,減少外周血紅細胞、白細胞和血小板數量,降低血栓及出血風險〔8〕,羥基脲聯合干擾素逐漸成為近幾年MPN治療的主流方法之一。PV患者經臨床治療后能否達完全控制對患者生存質量和預后均有一定的影響,部分患者經6個月以上的羥基脲聯合干擾素治療后雖達到了CHR,但是疾病相關癥狀仍然存在,這與羥基脲和干擾素對疾病相關細胞因子異常作用有限有關〔9〕。

基因甲基化是一種表觀遺傳機制,通過對DNA直接化學修飾建立新的甲基化模式,參與DNA 復制,胚胎發育,細胞有絲分裂等過程〔10〕。DNA甲基化還可募集基因調控相關蛋白,促使轉錄因子與 DNA 結合調節基因表達,在細胞轉錄、DNA 損傷修復、遺傳印記、惡性腫瘤發生等過程中發揮不可替代的作用〔11〕?，F有研究顯示部分基因甲基化與JAK2蛋白第617位的纈氨酸被苯丙氨酸代替(JAK2 V617F)突變MPN細胞增殖〔12〕有關。SOCS3是JAK/STAT 信號通路研究最徹底的抑制劑,JAK/STAT信號通路是細胞因子信號從細胞表面到細胞核信號傳遞的主要途徑,廣泛存在于各種組織和細胞中,參與細胞存活、增殖、遷移和入侵等多種生物過程,其過度激活與腫瘤發生密切相關。SOCS3通過將其 SH2 結構域與細胞因子受體或激活的JAK 中的磷酸酪氨酸殘基結合來抑制JAK激酶的活性及其下游STAT蛋白的磷酸化,阻斷JAK/STAT信號通路的激活,被認為是一種重要的腫瘤抑制因子,SOCS3表達異?；蚬δ苷系K與腫瘤侵襲、轉移有關〔13〕?，F有研究顯示,SOCS3 甲基化導致 SOCS3 低表達,導致JAK/STAT3信號通路持續激活和調節性T細胞表達增加,影響機體抗腫瘤免疫作用,導致小兒急性淋巴細胞白血病進展〔14〕。在MPN患者中,26.3%的PV、9.5%的原發性血小板增多癥,20%的原發性骨髓纖維化病例可檢測到SOCS3基因啟動子高甲基化〔15〕。

本研究說明,SOCS3基因甲基化可能引起PV骨髓三系(紅系、粒系、巨核系)細胞過度增生,增加血栓栓塞風險。JAK2 V617F突變被認為是MPN最常見的驅動因素,約95%的PV老年患者均可檢測到JAK2 V617F基因突變〔16〕。本研究說明,SOCS3基因甲基化對PV患者JAK2 V617F基因突變的影響較小,也可能與本研究招募樣本例數偏少有關。F?dermayr等〔17〕通過甲基化特異性 PCR檢測原發性血小板增多癥患者SOCS3基因甲基化程度,發現JAK2 野生型和突變患者間SOCS3基因甲基化并無差異性。

本文提示,SOCS3基因甲基化可能影響PV患者羥基脲聯合干擾素治療效果及預后。Zhang等〔18〕發現SOCS3在肝細胞癌中表達下調,SOCS3基因甲基化水平上調,SOCS3基因甲基化與肝細胞癌生存率低下有關。江傲霜等〔19〕檢測83例急性淋巴細胞白血病患兒SOCS3基因甲基化水平,發現初診組及復發組患兒SOCS3基因甲基化水平明顯高于完全緩解組,SOCS3甲基化高水平組累積復發率明顯高于低表達水平組。SOCS3啟動子區CpG島作為轉錄因子的結合位點,在SOCS3的轉錄激活中起著重要作用,SOCS3啟動子區CpG島異常高甲基化導致SOCS3基因失活和表達下調,引起JAK/STAT信號通路持續激活〔20〕,進一步促使抗凋亡基因過表達和腫瘤細胞增殖,最終導致對抗腫瘤治療反應性差和骨髓纖維化轉化。

綜上,PV老年患者SOCS3基因甲基化水平增高,SOCS3基因高甲基化與羥基脲聯合干擾素治療反應性差及骨髓纖維化轉化有關。檢測SOCS3基因甲基化有助于評估PV患者治療反應性和預后。本研究局限性在于樣本量偏少,隨訪時間過短,SOCS3基因甲基化與PV老年患者長期生存的關系尚待進一步驗證。