不同Hp感染的老年慢性胃炎患者S100蛋白表達及意義

卜佳 孫曼鑾 呂科 溫娟娟

(1山西大同大學醫學院,山西 大同 037009;2大同市第五人民醫院心內科)

慢性胃炎是多種病因所致的胃黏膜炎性病變,淋巴細胞浸潤為其主要特征,隨著病情的發展會出現胃黏膜腺體萎縮、化生、癌變〔1〕。老年慢性胃炎患者由于身體功能的減退,上消化道出血等并發癥的發生率明顯增加,威脅患者的生命安全〔2〕;同時老年慢性胃炎患者中發展為慢性萎縮性胃炎和胃癌的比例較高〔3〕。因此,準確評估老年慢性胃炎患者的病情發展對治療方案的合理制定具有重要意義。參與人體炎癥反應的因子中S100蛋白家族成員S100A8、S100A9具有獨特的生物學作用,是目前研究的熱點之一〔4〕。研究報道顯示,S100A8、S100A9可能參與幽門螺旋桿菌(Hp)感染誘發的人胃黏膜上皮永生細胞增殖異常和致炎過程〔5〕。本研究探究不同Hp感染情況的老年慢性胃炎患者S100蛋白表達特點及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年3月至2021年5月大同市第五人民醫醫院收治的老年慢性胃炎患者92例。入選標準:①診斷標準參照2017年全國慢性胃炎研討會中制定的中國慢性胃炎共識意見,經胃鏡下組織病理活檢確診為慢性胃炎;②接受碳13尿酸呼氣試驗,同時結合快速尿素酶試驗結果進行綜合判斷,二者均為陽性則診斷為Hp感染。排除標準:①近1個月有抗Hp類藥物或非甾體抗炎藥使用史者;②有精神性疾病或認知功能異常者。根據病理檢查結果分為慢性非萎縮性胃炎組39例,慢性萎縮性胃炎組53例。慢性非萎縮性胃炎組男21例,女18例;年齡60～78〔平均(68.24±5.08)〕歲。慢性萎縮性胃炎組男29例,女24例;年齡60～80〔平均(68.95±4.71)〕歲。兩組性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審批通過,患者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑 免疫組化SP法檢測試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑均購于北京拜爾迪生物有限公司;二甲苯、磷酸鹽緩沖液、過氧化氫溶液均購于北京博爾邁生物有限公司;放射免疫沉淀(RIPA)組織細胞裂解液購于上海博湖生物科技有限公司;兔抗人S100A8單克隆抗體、兔抗人S100A9單克隆抗體、辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG均購于北京康眾生物科技有限公司。

1.3標本采集及蘇木素-伊紅(HE)染色 胃鏡下隨機采集胃竇部黏膜組織標本兩塊,將其中一塊放于-80 ℃冰箱中凍存,另一塊放于4%甲醛溶液中固定,乙醇脫水后二甲苯透明,石蠟包埋。進行4 μm連續切片,脫蠟至水,進行HE染色3～5 min,蒸餾水沖洗,脫水、中性樹膠封片,光學顯微鏡下觀察。

1.4免疫組化檢測 取石蠟切片,脫水后加入濃度為3% H2O2,室溫下孵育30 min,使用磷酸緩沖液反復洗滌3次,使用10%的山羊血清封閉抗體,棄去血清,加入兔抗人S100A8單克隆抗體(稀釋比例1∶300)、兔抗人S100A9單克隆抗體(稀釋比例1∶500),4 ℃冷藏過夜,磷酸緩沖液反復洗滌3次,加入辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG,稀釋比例1∶2 000,37 ℃靜置30 min,使用增強型DAB底物試劑盒顯色,洗滌后復染,封片,在光學顯微鏡下觀察。染色結果判定:S100A8、S100A9主要分布于細胞核,陽性染色呈黃色、黃褐色。染色程度評分:0分(無染色),1分(淺黃色),2分(黃色),3分(黃褐色)。陽性細胞比例評分:1分(≤10%),2分(11%～50%),3分(51%～75%),4分(>75%)。兩項評分的乘積≥3分為陽性,<3分為陰性。

1.5RT-PCR檢測S100A8、S100A9 mRNA表達 Trizol法提取組織標本中的總RNA,逆轉錄為cDNA,S100A8、S100A9、β-actin引物序列由上海權陽生物有限公司設計、合成;S100A8上游引物:5′-GGCGACTCGTTATTGTTCAT-3′,下游:5′-GGGTATTACTTCGATAGTGC-3′。S100A9上游引物:5′-CGCGGGGCTACTGATTAGCGT-3′,下游:5′-TGTAAG-GCTTAGCAATCTCGA-3′。β-actin上游引物:5′-CAGTCCGTCGAGCATCG ATA-3′,下游:5′-GACATGCGGGTGTCACGACC-3′。PCR擴增條件:94 ℃預變性5 min,活化TagDNA酶,94 ℃變性20 s,55 ℃反應40 s,共40個循環,72 ℃終末延伸3 min。檢測各基因相對表達量。

1.6Western印跡檢測S100A8、S100A9蛋白表達 收集組織標本,使用高效RIPA組織細胞裂解液提取總蛋白,定量后取10 μg行電泳,將分離出的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜,室溫下封閉2 h。洗膜后加入1∶300倍稀釋的兔抗人S100A8單克隆抗體、1∶500倍稀釋的兔抗人S100A9單克隆抗體、1∶2 000倍稀釋的鼠抗β-actin單克隆抗體,4 ℃過夜,洗滌后加入1∶2 000稀釋辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG,室溫搖床孵育2 h,化學發光法成像,使用ImageJ軟件分析圖片條帶的灰度值。

1.7統計學分析 采用SPSS25.0軟件進行方差分析、t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1兩組S100A8、S100A9表達比較 慢性萎縮性胃炎組S100A8、S100A9表達陽性率明顯高于慢性非萎縮性胃炎組(P<0.01)。見表1。

2.2兩組S100A8、S100A9 mRNA和蛋白表達水平比較 慢性萎縮性胃炎組S100A8、S100A9 mRNA和蛋白表達水平均明顯高于慢性非萎縮性胃炎組(均P<0.01)。見表1。

2.3不同Hp感染情況患者S100A8、S100A9表達情況比較 92例老年慢性胃炎患者中Hp感染陽性52例(陽性組),陰性40例(陰性組)。Hp感染陽性的老年慢性胃炎患者S100A8、S100A9表達陽性率明顯高于Hp感染陰性的患者(P<0.01)。見表2。

2.4不同Hp感染患者S100A8、S100A9 mRNA和蛋白表達水平比較 Hp感染陽性的老年慢性胃炎患者S100A8、S100A9 mRNA和蛋白表達水平明顯高于Hp感染陰性患者(P<0.01)。見表2。

表1 兩組S100A8、S100A9陽性表達、mRNA及蛋白表達水平比較

表2 不同Hp感染患者S100A8、S100A9陽性表達、mRNA及蛋白表達比較〔n(%)〕

2.5各組S100A8、S100A9表達情況比較 慢性萎縮性胃炎合并Hp陽性組S100A8、S100A9表達陽性率明顯高于Hp陰性組,慢性非萎縮性胃炎合并Hp陽性組S100A8、S100A9表達陽性率明顯高于Hp陰性組(P<0.05)。慢性萎縮性胃炎合并Hp陽性組S100A8、S100A9表達陽性率明顯高于慢性非萎縮性胃炎合并Hp陽性組及Hp陰性組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

2.6各組S100A8、S100A9 mRNA和蛋白表達水平比較 慢性萎縮性胃炎合并Hp陽性組S100A8、S100A9 mRNA和蛋白表達水平明顯高于Hp陰性組,慢性非萎縮性胃炎合并Hp陽性組S100A8、S100A9 mRNA和蛋白表達水平明顯高于Hp陰性組(P<0.05)。慢性萎縮性胃炎合并Hp陽性組S100A8、S100A9 mRNA和蛋白表達水平明顯高于慢性非萎縮性胃炎合并Hp陽性組及Hp陰性組(P<0.05)。見表3。

表3 各組S100A8、S100A9陽性表達、mRNA及蛋白表達水平比較

3 討 論

慢性胃炎是胃癌發生的重要環節,進展過程分為慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎、腸化生、不典型增生〔6〕。關注慢性胃炎的發病機制對降低胃癌的發病率具有重要意義。相關研究顯示,Hp感染的胰島素胃泌素轉基因小鼠胃黏膜萎縮及不典型增生的發生時間明顯早于Hp感染陰性的小鼠〔7〕。國外流行病學研究報道顯示,Hp陽性的患者慢性萎縮性胃炎的發生風險高出陰性患者5倍以上,提示Hp感染與慢性萎縮性胃炎的發生密切相關〔8〕。同時Hp感染作為慢性萎縮性胃炎的主要病因已得到廣泛認可〔9〕,但具體致病機制仍未完全明確。S100A8、S100A9均屬于S100蛋白家族成員,存在形成主要為S100A8/S100A9異源二聚體〔10〕。研究發現S100A8、S100A9 參與炎癥發展過程,且能夠調控細胞增殖、凋亡等過程〔11〕。自身免疫性疾病、感染性炎癥及胰腺癌、結直腸癌等惡性腫瘤患者中S100A8、S100A9高表達〔12〕。

研究顯示,Hp感染會誘發人胃黏膜上皮永生細胞異常增殖,具體表現為低水平Hp活菌感染時人胃黏膜上皮永生細胞增殖活性提升,高水平Hp活菌感染時其增殖活性被抑制〔13〕。研究顯示,Hp感染的人胃黏膜上皮永生細胞S100A8、S100A9 mRNA和蛋白表達水平均明顯提升,且與人胃黏膜上皮永生細胞增殖紊亂、腫瘤壞死因子α濃度呈正相關〔14〕,提示S100A8、S100A9 可能參與了Hp誘導人胃黏膜上皮永生細胞炎癥反應異常及增殖紊亂過程。本研究結果說明S100A8、S100A9高表達可能參與慢性胃炎的發生與發展,且S100A8與S100A9表達變化趨勢相同,進一步證實了S100A8/S100A9異源二聚體存在的結論;胃黏膜組織中S100A8、S100A9表達水平與Hp感染情況密切相關。研究顯示,細胞外S100A8、S100A9與免疫細胞表面的Toll樣受體4、RAGE等受體結合,發揮正反饋作用,生成級聯信號,大量合成并分泌趨化因子、細胞因子、一氧化氮等,導致細胞外微環境改變,細胞形態出現變化或細胞中DNA發生損傷,周圍細胞出現異常增殖和凋亡〔15〕。胃黏被Hp感染后可刺激黏膜組織中S100A8、S100A9的大量合成與分泌,進而激活核因子κB信號,與免疫細胞表面的Toll樣受體4、RAGE等結合后誘發炎癥級聯信號,改變局部微環境,影響胃黏膜上皮細胞增殖與分化,固有腺體減少造成慢性胃炎的發生與發展。