食源性致病微生物阪崎腸桿菌核酸檢測試劑盒的研究

萬宇平 馬玉華 賈芳芳 王琳琛

食品安全問題一直是社會各界關注的重點。世界衛生組織曾報道稱，食源性疾病是受全球關注的衛生問題，更是影響人類健康的重要因素，而病原微生物感染則是導致食源性疾病發生的主要因素。阪崎腸桿菌在2002年被國際食品微生物標準化委員會（ICMSF）確定為食源性致病菌，如被阪崎腸桿菌感染可能會引起嬰幼兒尤其是新生兒患病，如腦膜炎、菌血癥及壞死性小腸結腸炎等，更有甚者會引起嚴重的后遺癥或死亡。有數據顯示，目前只有嬰幼兒奶粉與這一疾病的爆發相關。

傳統的致病微生物檢測方法有國標法和紙片法，但因操作復雜且測試周期過長，其已經無法跟上經濟發展的步伐，不能滿足我國快速發展的食品行業對食品檢測工作的需求。因此，建立一種在嬰幼兒奶粉中快速、高效、靈敏的檢測阪崎腸桿菌的方法至關重要。

本研究是一種基于環介導等溫擴增技術而開發的快速檢測食品中阪崎腸桿菌的方法。環介導等溫基因擴增技術（Loop Mediated Isothermal Amplification，以下簡稱“LAMP法”）是日本榮研株式會社研究發明的核酸等溫擴增方法，其利用4個特殊的引物特異識別靶基因的6個特定區域，采用具有強鏈置換活性的BstDNA聚合酶，實現在恒溫條件下的體外擴增。本研究根據阪崎腸桿菌的16-23S基因設計了6條引物，并將其與目的基因的6個區域相結合，具有特異性強、靈敏度高的優點。本試劑盒能在60min內完成擴增反應，且技術要求低，具有快速、簡便等優點，能有效解決傳統檢測方法耗時長、結果可靠性差等問題，適合各級實驗室及基層單位推廣使用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

引物、DNA聚合酶、dNTP、MgSO4、Buffer緩沖液、顯色劑、DNA提取液。

PCR擴增儀。

1.2 環介導等溫基因擴增反應體系

1.2.1 制備環介導等溫基因擴增反應體系

6條引物分別如下：內引物1為5 -TAGCCAACCGATGTTTCTGTATCAAACAATACTACAAAGGTGCTTTCG-3（SEQ ID No.1）；內引物2為5-AGAAGTCATTAGCGAACAGGCTACGCGTAAGATTCTTGCTCAGTAG -3（SEQ ID No.2）；外引物1為5-GTGAGAACGGGACCATCA -3（SEQ ID No.3）；外引物2為5- CTTGTTTTTGTAGGGTTTGGA-3（SEQ ID No.4）；環引物1為5-GACTTCTTCGGGTTGTGAGG- 3（SEQ ID No.5）；環引物2為5-GATTAGCACGTCCTTCATCG- 3（SEQ ID No.6）。

DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶，濃度為8U/μL；dNTP：濃度為25mM；MgSO4：濃度為50mM；Buffer緩沖液：10×buffer；顯色劑：熒光染料1000×SYBR Green I；DNA提取液。

1.2.2 鑒定阪崎腸桿菌與非阪崎腸桿菌

本實驗所述待檢樣品為添加阪崎腸桿菌的奶粉樣本。

模板DNA提?。簩?mL的樣本置于1.5mL離心管；12000r/min離心2min，棄上清；然后加入DNA提取液80μL，煮沸10min；最后離心取上清液轉移至另一支離心管中作為模板DNA。

環介導等溫基因擴增反應：在200μL PCR管配制反應體系，外引物終濃度為0.2μM，內引物、環引物終濃度為0.6μM，1×buffer反應緩沖液，3mM MgSO4，0.5mM dNTP，8U Bst DNA聚合酶，樣本模板2.5μL，超純水補足25μL，然后加入30μL的密封液，將上述反應管于65℃反應60min。

結果判定：在上述反應管中加入1μL 1000×SYBR Green I，混勻后觀察反應液的顏色，若呈現綠色則為阪崎腸桿菌，橙色則為非阪崎腸桿菌。

檢測結果：PCR管呈現綠色，表明待檢樣品所感染的致病菌為阪崎腸桿菌。

1.3特異性與靈敏度

1.3.1檢測材料及方法

菌株：金黃色葡萄球菌ATCC 6538、單增李斯特菌CMCC（B） 54002、副溶血性弧菌 ATCC 17802、福氏志賀氏菌CMCC（B） 51572、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028、阪崎腸桿菌CMCC 45410、陰溝腸桿菌CMCC45301、赫氏艾希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希氏菌O157 H7 ATCC 43888、大腸埃希氏菌25922、威氏李斯特CICC21672、綿羊李斯特CICC21633、格氏李斯特CICC21670。

食品樣本：幼兒配方奶粉、米粉、營養快線、奶片、鈣奶餅干。

檢測方法：對各個樣本的檢測嚴格按照說明書進行操作，同時與國標方法GB 4789.40-2010進行對比。

2 結果與分析

2.1 特異性

對常見食源性致病菌菌株及同源性高的菌株提取基因組DNA（按說明書制備基因組DNA），采用核酸檢測試劑盒進行單一和交叉污染檢測，每個樣品均進行2次重復檢測，并同時設立檢測試劑盒的陰性和陽性對照。（見表1）

結果顯示，僅含阪崎腸桿菌的樣品顯示陽性結果，其余樣品均為陰性，表明該試劑盒具有高度特異性。

2.2 靈敏度

純菌靈敏度（CFU/mL）：取計數后菌液進行梯度稀釋（100μL菌液+900μL超純水），按說明書提取DNA模板。取不同濃度梯度測試，每個梯度作兩個平行。

實際樣本靈敏度[CFU/25g（mL）]：取計數后菌液進行梯度稀釋（100μL菌液+900μL超純水），分別取約≥10CFU、<10CFU稀釋液進行樣本添加，置于均質袋內，按國標方式培養后，取200μL培養液上清提取模板檢測。

2.2.1純菌靈敏度（見表2）

結果顯示：純菌靈敏度數量級為102，但大量實驗結果證實，由于模板提取、稀釋誤差等原因，靈敏度數量級可能為103。因此，純菌靈敏度約為102～103CFU/mL。

2.2.2實際樣本靈敏度（見表3）

結果顯示，實際樣本的靈敏度均可達到≤10CFU/25g，個別樣本靈敏度試劑盒方法高于國標方法。

2.3 批間、批內差（“+”為陽性、“-”為陰性）

以嬰幼兒配方奶粉為樣本，進行不同量的陽性菌添加（無添加、≥10CFU、<10CFU）并制備成不同濃度的樣品，每個樣品作3個平行，3次重復，測試3批檢測試劑，同時設立陰陽對照組。（見表4）

根據實驗結果，按照公式計算，試劑盒的批內差為0%，批間差為0%，說明試劑盒穩定性較好。

2.4 國標符合率

以嬰幼兒配方奶粉、奶片、營養快線、鈣奶餅干、米粉為樣本，使用不同濃度陽性菌進行樣本添加，采用核酸檢測試劑盒與國標方法同時進行檢測，比較兩種方法的檢測結果，每個檢測樣本進行3個重復檢測，同時設立試劑盒的陰性對照和陽性對照。（見表5）

結果顯示，不同樣本的檢測結果與國標一致。因此，試劑盒檢測方法與國標檢測方法的符合率為100%。

3 驗證評價

驗證實驗表明，北京勤邦生物技術有限公司研發的阪崎腸桿菌核酸檢測方法簡單、快捷，不需要大型儀器設備；純菌檢測靈敏度為102～103CFU/mL，實際樣本靈敏度均可達到≤10CFU/25g，試劑盒具有較高特異性，產品批內及批間無明顯差異，實際樣本檢測國標符合率為100%。