基于序列的多重聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)獻(xiàn)血者HLA/HPA基因分型

陳星星 倪修文 李璋 許先國(guó)

在醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，成分輸血技術(shù)的應(yīng)用范圍不斷提升，血小板輸注已發(fā)展為治療血小板減少以及功能障礙所致疾病的關(guān)鍵療法。然而，在血小板輸注次數(shù)增加的情況下，患者常會(huì)面臨血小板輸注無(wú)效（platelet transfusion refractory，PTR）的問(wèn)題［1］，導(dǎo)致PTR重要原因可分為免疫性因素及非免疫性因素。免疫性因素主要包括人類(lèi)白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）抗體、血小板同種抗原（human platelet antigen，HPA）抗體、CD36抗體等。據(jù)調(diào)查顯示，免疫性血小板抗體造成的PTR占18%～25%［2］，HLA和HPA基因型的配合性輸注是有效解決PTR的重要方式之一［3］。為解決PTR的發(fā)生，需要分析本地區(qū)血小板獻(xiàn)血者HLA-A、B及HPA基因分布特點(diǎn)，并建立相應(yīng)的區(qū)域性血小板供應(yīng)庫(kù)，為患者提供與其抗原相匹配的單采血小板，從而有效降低PTR的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2020年1月至2021年12月期間5,411例獻(xiàn)血者樣本進(jìn)行HLA-I類(lèi)（A、B）基因測(cè)序，對(duì)其中199例單采血小板獻(xiàn)血者樣本進(jìn)行HPA1-6、15、21w系統(tǒng)基因分型研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有參與者須滿足《獻(xiàn)血者健康檢查要求》，年齡在18～45歲之間，血小板捐獻(xiàn)次數(shù)≥2次。此項(xiàng)研究已通過(guò)嘉興市中心血站倫理審查委員會(huì)審批，均已簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑與儀器 人類(lèi)基因組DNA提取試劑由美國(guó)Roche公司提供；HLA-A、B基因分型試劑由中國(guó)臺(tái)灣TBG公司提供；HPA基因分型試劑由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司提供。9700型PCR擴(kuò)增儀由美國(guó)ABI公司提供；凝膠成像系統(tǒng)由美國(guó)BIO-RAD伯樂(lè)公司提供；電泳儀由美國(guó)BIO-RAD伯樂(lè)公司提供；ABI 3730基因測(cè)序儀由美國(guó)ABI公司提供。

1.3 DNA提取 留取獻(xiàn)血者的血液標(biāo)本5 mL，采用EDTA-Na2進(jìn)行抗凝，通過(guò)MagNA Pure 96全自動(dòng)DNA提取系統(tǒng)（購(gòu)自美國(guó)Roche公司）。實(shí)驗(yàn)中選定提供方為美國(guó)Roche公司的DNA提取試劑盒（MagNA Pure 96DNA and Viral NA Large Volume Kit）開(kāi)展DNA提取工作，調(diào)整DNA濃度為30～50 ng/μL，純度A260/A280為1.6～2.0，嚴(yán)格依據(jù)說(shuō)明書(shū)操作。

1.4 HLA-I類(lèi)基因分型 對(duì)入庫(kù)的血小板捐獻(xiàn)者分別對(duì)HLA-A、HLA-B基因進(jìn)行分型，采取multiplex PCR-SBT法對(duì)HLA-I類(lèi)基因（HLA-A和HLA-B位點(diǎn)）進(jìn)行高分辨分型檢測(cè)，使用中國(guó)臺(tái)灣TBG公司提供的HLA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)為：A位點(diǎn)AA19091K、B位點(diǎn)AB19091K）對(duì)HLA-A、HLA-B基因的第2-4外顯子進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化后，上ABI 3730基因測(cè)序儀進(jìn)行電泳分析，利用uTYPE7.3分析軟件指定標(biāo)本的HLA-A、HLA-B基因型。

1.5 HPA擴(kuò)增和基因分型 HPA擴(kuò)增和基因分型方法參照文獻(xiàn)［2］執(zhí)行：PCR擴(kuò)增在ABI 9700熱循環(huán)儀上進(jìn)行，擴(kuò)增條件為95 ℃5 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72℃1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)電泳在2%瓊脂糖凝膠中用0.5 μg/mL乙錠溴化物染色并通過(guò)紫外光進(jìn)行可視化分析。在ABI 3730 DNA分析儀上處理序列反應(yīng)產(chǎn)物，并使用SeqScape 2.5軟件（美國(guó)生物應(yīng)用系統(tǒng)公司）分析序列數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 HLA和HPA基因頻率計(jì)算公式：基因頻率=基因數(shù)/總基因數(shù)；基因型頻率=基因型數(shù)/總基因型數(shù)。采用SPSS25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。aa或bb期望值=p 2*N或q 2*N，ab期望值=2*pq*N（p和q分別為a和b的基因頻率）。基于群體遺傳Hardy-Weinberg（H-W）平衡這一角度，來(lái)驗(yàn)證是否符合H-W平衡。具體來(lái)看，計(jì)算各系統(tǒng)對(duì)偶抗原不配合概率（血小板隨機(jī)輸注HPA錯(cuò)配概率）的具體公式：MMP=a 2（1-a2）+b2（1-b2）=2ab（1-ab），a、b代表對(duì)偶抗原等位基因頻率。

2 結(jié)果

2.1 嘉興地區(qū)獻(xiàn)血人群HLA-A、B基因頻率 樣本中共檢出 HLA-A、B位點(diǎn)等位基因66種。HLA-A位點(diǎn)等位基因15個(gè)，頻率前5位為A*2（0.3040）、A*11（0.2384）、A*24（0.1771）、A*33（0.0893）、A*30（0.0493）。HLA-B位點(diǎn)等位基因38個(gè)，頻率前5位為B*46（0.1137）、B*60（0.1136）、B*13（0.0931）、B*62（0.0822）和B*58（0.0820）。各等位基因頻率見(jiàn)表1，基因頻率較高（＞2%），見(jiàn)表2。

表1 嘉興地區(qū)獻(xiàn)血人群HLA-A、B基因頻率（n=5,411）

表2 嘉興地區(qū)HLA-A、B基因頻率（基因頻率＞2%）

2.2 嘉興地區(qū)HPA1～6、15、21w基因分布及基因型頻率 HPA1～6、15、21w系統(tǒng)與Hardy-Weinberg遺傳平衡定律相契合，說(shuō)明系統(tǒng)具有恒定性。由數(shù)據(jù)可知，HPA-3和HPA-15系統(tǒng)的基因型雜合度、對(duì)偶抗原不配合率均最高，HPA-3雜合度（a/b雜合子基因型）最高（0.482），其次為HPA-15（0.437），HPA-3、15系統(tǒng)中a、b抗原頻率相近，HPA-3、15系統(tǒng)有b/b純合子基因型，分別為0.196、0.266；其余5個(gè)系統(tǒng)均以a/a純合子基因型為主，分別為0.995、0.8995、0.990、0.975、0.945，未見(jiàn)bb基因型（表3）。

表3 嘉興地區(qū)HPA基因頻率（n=199）

2.3 嘉興地區(qū)單采血小板獻(xiàn)血者HPA基因頻率與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)比較分析 嘉興地區(qū)HPA1～6、15、21w基因分布與其他9個(gè)地區(qū)兩兩比較，均無(wú)明顯差異（P＞0.05）（表4）。

3 討論

基于相關(guān)理論研究與實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇HLA匹配的血小板或者HLA和HPA均匹配的血小板是減少PTR的方法。研究HLA和HPA基因的多態(tài)性分布特征，可更好地預(yù)測(cè)本地血小板特異性同種免疫的發(fā)生，制定更加精準(zhǔn)的血小板同種免疫性疾病篩查方案，更大限度避免PTR的發(fā)生。

本研究通過(guò)分析獲取了嘉興地區(qū)HLA和HPA基因的多態(tài)性分布頻率特征，具體結(jié)論如下：第一，與蘇湘暉等［4］以及黃璐等［5］的研究相比，本研究發(fā)現(xiàn)HLA基因頻率在不同地域之間存在明顯差異。因此，在建立HLA基因型數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)［6］，應(yīng)綜合考慮地域人群的分布特點(diǎn)。第二，HPA3a/3b、HPA15a/15b的基因組存在顯著的遺傳多態(tài)性，這與王曉偉［7］的研究結(jié)果一致。并且HPA3系統(tǒng)的雜合程度較高，僅次于HPA15［8］。對(duì)偶抗原不配合的概率從高到低依次為HPA-3、15、2、6、21、5系統(tǒng)，這與劉艷等［9］研究結(jié)果不同，可能與該地區(qū)的遺傳多樣性有關(guān)。此外，嘉興地區(qū)HPA2a/2b的基因雜合程度高于HPA1a/1b，意味著由于HPA2系統(tǒng)不相容導(dǎo)致的免疫性血小板減少癥的發(fā)病率可能高于HPA1系統(tǒng)。第三，通過(guò)比較嘉興地區(qū)與其他9個(gè)地區(qū)的HPA1-6、15、21w基因的分布，本研究發(fā)現(xiàn)HPA基因的頻率分布在不同地區(qū)間無(wú)明顯差異，這與周丹等［10］的研究結(jié)論不同，可能與本研究基因庫(kù)的規(guī)模相對(duì)較小有關(guān)。

綜上所述，嘉興地區(qū)獻(xiàn)血者HLA和HPA基因分布，并構(gòu)建機(jī)采血小板基因信息數(shù)據(jù)庫(kù)，為有效應(yīng)對(duì)嘉興地區(qū)的PTR問(wèn)題提供了支撐。本研究尚存在不足之處，基因庫(kù)規(guī)模有限，后續(xù)需擴(kuò)大樣本量以收集更全面的數(shù)據(jù)［11］，從而有效避免同種免疫反應(yīng)引起的問(wèn)題，并減少血液資源的浪費(fèi)。