電針對(duì)CCH大鼠認(rèn)知能力及海馬p-JAK2、p-STAT3水平的影響

程瑩瑩 艾琪 韓德雄 吳磊 劉婧 李璐

慢性腦灌注不足（Chronic cerebral hypoperfusion，CCH）長(zhǎng)期低灌注使腦組織產(chǎn)生能量代謝異常、氧化應(yīng)激、炎性細(xì)胞因子釋放、神經(jīng)元凋亡［1］等病理變化，可導(dǎo)致認(rèn)知力下降，是阿爾茨海默病（AD）、血管性癡呆（VD）和Binswanger病等疾病共同的病理基礎(chǔ)，其損傷機(jī)制尚不完全清楚，且不能闡述電針改善認(rèn)知功能的確切機(jī)制。研究表明JAK2/STAT3磷酸化活化后與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合導(dǎo)致進(jìn)一步的病理?yè)p傷，而去磷酸化失活后即能阻斷其異常表達(dá)，因此，本研究采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法（2-VO）構(gòu)建CCH模型，采用電針干預(yù)，了解大鼠海馬組織p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)，旨在研究電針對(duì)JAK2、STAT3磷酸化水平的作用，探討電針改善CCH認(rèn)知能力的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來(lái)源 從浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)置健康清潔級(jí)雄性SD大鼠（3～4月齡）40只，體質(zhì)量為（200±20）g，置于標(biāo)準(zhǔn)籠中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，溫度為18 ℃～22 ℃，相對(duì)濕度4%～50%，維持12 h/12 h的明暗周期。本研究通過(guò)浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（No.ZSLL-2017-191）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）造模與分組：造模前對(duì)所有大鼠進(jìn)行局灶性腦血流（rCBF）檢測(cè)和Morris水迷宮測(cè)試逃避潛伏期評(píng)價(jià)。術(shù)前1 d，所有大鼠進(jìn)行稱重，術(shù)前12 h禁食，4 h禁水，用10%水合氯醛（40 mg/kg體質(zhì)量）腹腔注射麻醉，采用2-VO法制備CCH模型，在37 ℃環(huán)境中大鼠完全蘇醒后，進(jìn)行Morris水迷宮、rCBF檢測(cè)、分組或予以平衡處理。假手術(shù)組除了不行雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎，其余操作同模型組。3只大鼠在造模過(guò)程中死亡，2只Morris水迷宮試驗(yàn)中死亡，4只造模后逃避潛伏期無(wú)變化被剔除，根據(jù)計(jì)算機(jī)產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)字，將造模成功過(guò)后的大鼠，隨機(jī)分為模型組（Model）、假電針組（Sham EA）、電針組（EA），每組各10只。假手術(shù)組（Sham）亦10只。（2）干預(yù)方法：EA組給予連續(xù)4周的電針干預(yù)，Sham EA除不進(jìn)行電刺激外，其他操作同EA組。Sham組和Model組采取的抓取、固定、檢測(cè)、處死同EA組，不予針刺干預(yù)。EA組取穴：參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［2］大鼠定位取穴，取“百會(huì)”、“大椎”穴電針：采用0.30 mm×25 mm無(wú)菌針灸針，百會(huì)穴沿頭部正中向后平刺約0.5 ㎝，大椎穴直刺約0.5 cm，兩穴不區(qū)分正負(fù)極接韓式穴位神經(jīng)刺激儀，參數(shù)為2/15 Hz疏密波，電流為（2±1）mA，持續(xù)時(shí)間30 min，每天上午在實(shí)驗(yàn)室治療1次，5次/周，周末休息。（3）腦組織取材：第28天完成Morris水迷宮和rCBF后，對(duì)每只大鼠進(jìn)行稱重后以10%水合氯醛采用腹腔注射方式麻醉。每只大鼠經(jīng)200 mL0.9%氯化鈉溶液快速灌注沖洗至肝臟發(fā)白，將大鼠斷頭置于冰臺(tái)快速分離取出新鮮海馬組織（分左、右兩部分）置于防凍管中，迅速置于液氮速凍，稍后移至-80 ℃冰箱保存。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo) （1）局部腦血流檢測(cè)：采用PeriFlux 5000激光多普勒血流儀配合PROBE403 探頭檢測(cè)各組大鼠造模前（Pre-op）、造模成功后（Post-op）、術(shù)后1周、術(shù)后2周、術(shù)后4周大鼠局部腦血流（Regional cerebral blood flow，rCBF）。檢測(cè)點(diǎn)為大鼠右眼目外眥與外耳道孔連線的中點(diǎn)，消毒后，在兩點(diǎn)之間剪一約1 cm的橫向切口，鈍性分離局部皮下組織，暴露出骨平面，用棉球清理骨平面組織液；同時(shí)為防止腦血流檢測(cè)過(guò)程中不斷滲出的液體干擾，用棉球蘸取適量3%雙氧水清理骨表面。（2）Morris水迷宮行為學(xué)評(píng)價(jià)：通過(guò)Morris水迷宮評(píng)價(jià)大鼠的學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知、定向能力。大鼠造模成功后第23天開(kāi)始評(píng)定，前5 d連續(xù)進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)測(cè)試，第6天進(jìn)行空間探索試驗(yàn)。定位航行試驗(yàn)：大鼠造模后第23天開(kāi)始，連續(xù)進(jìn)行5 d，2次/d。軟件自動(dòng)記錄大鼠逃避潛伏期。空間探索試驗(yàn)：在定位航行試驗(yàn)完成后（大鼠處死當(dāng)天），撤出平臺(tái)，分別于4個(gè)入水點(diǎn)將大鼠放入水中，記錄60 s內(nèi)大鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間。（3）Western Blot檢測(cè)海馬蛋白表達(dá)：海馬組織總蛋白的提?。禾崛〔襟E和方法嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行，完成后放置于-80℃冰箱保存。（4）蛋白濃度檢測(cè)：根據(jù)BCA法，嚴(yán)格按照操作規(guī)程準(zhǔn)備蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，配制BCA工作液，用分光光度計(jì)獲得吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品蛋白濃度。Western Blot：組織樣本提取完成后用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，并加入loading buffer進(jìn)行蛋白變性。配置5%濃縮膠、12%的分離膠進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。分別加入兔抗鼠GAPDH（1∶2,000）、SOCS3（1∶1,000）、JAK2（1∶1,000）、STAT3（1∶1,000）4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌后，加入相對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育2 h，隨后ECL顯色。使用GE ImageQuant LAS4000凝膠成像儀掃膜并進(jìn)行灰度值分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示。Morris行為評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析。組間比較方差齊性時(shí)采用LSD法，方差不齊時(shí)采用Dunnett-t檢驗(yàn)。同組干預(yù)前后用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組rCBF情況 各組大鼠術(shù)前rCBF差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模成功后，與Sham組比較，Model組、Sham EA組和EA組大鼠不同時(shí)相rCBF均顯著下降（P＜0.01），且Model組、Sham EA組和EA組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與同時(shí)相Sham組比較，Model組、Sham EA組、EA組大鼠的rCBF均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與同時(shí)相Model組比較，Sham EA組在造模后2周、4周時(shí)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），EA組在造模后1周、2周和4周時(shí)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。與同時(shí)相Sham EA組比較，EA組在造模后2周和4周時(shí)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組腦血流變化比較［（±s），PU］

表1 各組腦血流變化比較［（±s），PU］

注：與同時(shí)相Sham組比較，*P＜0.01；與同時(shí)相Model組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01；與同時(shí)相Sham EA組比較，△P＜0.05

組別只數(shù)缺血時(shí)間Pre-opPost-op1周2周4周Sham1098.21±2.0398.63±2.0198.02±2.0897.76±2.04100.07±2.10 Model1096.28±1.8935.48±1.29*49.83±2.51*61.59±1.65*71.31±2.19 Sham EA10103.32±2.1133.32±1.57*51.43±2.49*67.11±2.35*#76.79±2.05*#EA1099.92±1.9634.21±1.74*57.45±1.95*#72.97±1.35*▲△85.84±0.87*▲△

2.2 逃避潛伏期 第1天各組大鼠之間逃避潛伏期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與同時(shí)相Sham組比較，Model組大鼠潛伏期縮短緩慢，在第2天至第5天差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Sham EA組大鼠潛伏期縮短較快，在第2天至第5天差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）；EA組大鼠潛伏期縮短迅速，第2天和第3天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在第4天和第5天時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與同時(shí)相Model組比較，Sham EA組大鼠和EA組大鼠潛伏期均縮短較快，在第3天開(kāi)始至第5天差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。與同時(shí)相Sham EA組比較，EA組大鼠在第4天和第5天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組逃避潛伏期比較［（±s），s］

表2 各組逃避潛伏期比較［（±s），s］

注：與同時(shí)相Sham組比較，*P＜0.01，#P＜0.05；與同時(shí)相Model組比較，▲P＜0.05，△P＜0.01；與同時(shí)相Sham EA組比較，○P＜0.05

組別只數(shù)時(shí)間第1天 第2天 第3天第4天第5天Sham1046.86±2.1425.79±2.6517.73±2.2514.7±1.7513.02±1.69 Model1052.1±2.3744.71±3.79*40.86±2.93*36.6±2.24*35.46±3.33*Sham EA1048.41±2.7237.59±3.66#30.6±3.85▲24.86±2.4*△24.95±2.08*△EA1047.23±2.0136.59±3.41#▲27.86±2.41#△17.28±2.76△○16.16±2.31△○

2.3 空間探索試驗(yàn) 與Sham組比較，Model組大鼠和Sham EA組大鼠探索時(shí)間明顯縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），EA組大鼠探索時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與Model組比較，Sham EA組大鼠和EA組大鼠探索時(shí)間均有增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）；與Sham EA組比較，EA組大鼠探索時(shí)間更長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 各組空間探索60 s平臺(tái)象限停留時(shí)間比較［（±s），s］

表3 各組空間探索60 s平臺(tái)象限停留時(shí)間比較［（±s），s］

注：與Sham組比較，*P＜0.01；與Model組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01；與Sham EA組比較，ΔP＜0.05

組別只數(shù)平臺(tái)象限停留時(shí)間Sham組1021.26±1.46 Model組109.87±1.31*Sham EA組1014.47±1.39*#EA組1020.18±1.81▲Δ

2.4 各組大鼠p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)水平 見(jiàn)圖1-2。

圖1 各組p-JAK2表達(dá)水平。

圖2 各組p-STAT3表達(dá)水平。

3 討論

JAK/STAT是一條可被多種細(xì)胞因子調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，主要由酪氨酸激酶（JAK）家族、酪氨酸激酶相關(guān)受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（STAT）家族組成［3］，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、應(yīng)激、免疫和代謝調(diào)節(jié)等過(guò)程中發(fā)揮著舉足輕重的作用，同時(shí)參與各種組織和器官缺血、缺氧和氧化應(yīng)激［4］，是參與小膠質(zhì)細(xì)胞活化調(diào)節(jié)的關(guān)鍵，抑制該通路的異常激活，可以減輕小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，抑制炎性因子釋放，減輕炎性損傷，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［5］。

在JAK/STAT通路的傳導(dǎo)過(guò)程中，先是受體各類細(xì)胞因子進(jìn)行特異性結(jié)合，在細(xì)胞膜上形成二聚體，然后與JAKs結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，磷酸化進(jìn)而活化，活化的JAKs進(jìn)一步結(jié)合胞漿內(nèi)STATs，使STATs磷酸化，磷酸化的STATs然后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與DNA上的特定基因序列結(jié)合，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，參與上述多種生理、病理過(guò)程［6］。慢性腦灌注不足后會(huì)釋放大量的炎性細(xì)胞因子如IL、TNF-α、γ-IFN，引起JAK2/STAT3通路異常激活。一方面，炎性因子與相應(yīng)配體結(jié)合，促使膠質(zhì)細(xì)胞中的JAK2、STAT3磷酸化，激活小膠質(zhì)細(xì)胞，加重缺血、缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)損傷，同時(shí)在炎性因子的作用下，JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)一步上調(diào)，正反饋活化小膠質(zhì)細(xì)胞，形成惡性循環(huán)［7］，不斷加重腦組織的慢性缺血、缺氧損傷，使認(rèn)知障礙逐漸加劇。

本研究采用公認(rèn)的2-VO法造模，結(jié)果顯示電針“百會(huì)”、“大椎”可提高CCH大鼠的rCBF，改善腦低灌注狀態(tài)，下調(diào)CCH后JAK2/STAT3的過(guò)度磷酸化水平提高學(xué)習(xí)記憶能力。隨著我國(guó)老齡化社會(huì)的不斷加劇，慢性腦灌注不足人群不斷增大，并且由于不良用頸習(xí)慣、飲食方式的影響，慢性腦低灌注甚至開(kāi)始波及中青年，因此，本研究結(jié)果提示對(duì)于慢性腦低灌注人群進(jìn)行針灸干預(yù)，能改善認(rèn)知功能，提高認(rèn)知障礙人群生活質(zhì)量，減輕家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)。本研究主要著眼于電針對(duì)慢性腦低灌注海馬JAK2/STAT3的磷酸化水平的作用，現(xiàn)有研究顯示，JAK/STAT信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子包括3大類：活化STAT蛋白抑制因子（PIAS）、細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白（SOCS）家族、蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPs）族［8］，下一步可以該通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子為切入點(diǎn)，研究電針對(duì)JAK2/STAT3及負(fù)性調(diào)節(jié)因子的效應(yīng)，進(jìn)一步闡釋電針改善認(rèn)知功能的可能機(jī)制。