青藤堿對阿霉素誘導的局灶節段腎小球硬化大鼠足細胞損傷的干預作用及機制分析

林宜 張華琴 唐玥雯 萬鳳 湯絢麗 鄭潔 葉田

原發性局灶節段硬化性腎小球腎炎（Primary focal segmental glomerulosclerosis，FSGS）特征為腎小球局灶節段硬化和足細胞足突彌漫融合，其發病率逐年升高［1］。瞬時受體電位陽離子通道蛋白6（Transient receptor potential cation channel 6，TRPC6）表達于足細胞［2］，如其發生過表達，或基因突變后鈣離子內流增加，可致足細胞損傷、大量蛋白尿、FSGS及腎衰竭［3］。中醫藥在治療慢性腎病中具有一定療效［4］，青藤堿為中藥青風藤的主要單體生物堿，有免疫抑制、抗炎等作用［5］。迄今并無青藤堿干預FSGS的報道。近來有報道表明青藤堿可抑制多種細胞的鈣離子內流而減低細胞內鈣離子水平［6-8］，從而發揮抗炎等多種生物學作用。故作者推測青藤堿也可能通過抑制TRPC6通道，干預FSGS，故探討青藤堿對TRPC6鈣離子通道影響，以闡述其干預阿霉素誘導的FSGS大鼠足細胞損傷的作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）實驗大鼠：體質量180～220 g健康雄性Wistar大鼠87只［上海斯萊克實驗動物有限責任公司，SCXK（滬）2022-0004］。（2）主要藥物、試劑：他克莫司膠囊0.5 mg×50粒（FK506）（中美華東，批號220761），鹽酸青藤堿（湖南正清制藥集團股份有限公司，批號YK-221005），10 mg注射用鹽酸多柔比星（阿霉素注射液）（深圳萬樂藥業有限公司，批號2206E2），NPHS2抗體、TRPC6抗體、GAPDH抗體（ProteinTech），Nephrin 抗體（Immunoway），肌酐、白蛋白、尿總蛋白試劑（貝克曼庫爾特股份有限公司）。

1.2 方法 （1）FSGS腎病大鼠模型建立［9］：Wistar大鼠適應性喂養1周，選取健康大鼠（24 h尿蛋白定量＜10 mg）。禁食/給水12 h，造模組行單側腎臟切除，第7天和28天，以5 mg/kg和3 mg/kg的劑量尾靜脈注射阿霉素。首次注射阿霉素7 d（即0周）留取24 h尿液，檢測24 h蛋白定量顯著增加，提示造模成功。（2）實驗分組和給藥方法：正常對照組12只，造模成功的FSGS大鼠分為5組：參照文獻取青藤堿劑量［10］，低劑量組［20 mg/（kg·d）］、中劑量組［40 mg/（kg·d）］、高劑量組［60 mg/（kg·d）］，FK506為鈣調蛋白抑制劑，可下調足細胞TRPC6減少尿蛋白［11］，故設立FK506組［1 mg/（kg·d）］為陽性對照組。以上每組各15只。造模后第8天開始灌胃給藥，模型組和對照組按等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。給藥第28天，處死大鼠。（3）標本采集檢測：造模后0、4周將大鼠放置于代謝籠，留24 h尿；第28天腹主動脈采血行生化檢測，處死后取腎皮質置凍存管。（4）腎臟病理檢測：取10%中性福爾馬林固定的腎皮質行蘇木精-伊紅（HE）、過碘雪夫酸（PAS）染色；腎皮質以3.75%戊二醛及2%鋨酸雙固定后，行免疫組化檢測。以萊卡病理圖像系統采集圖像，image pro plus6.0軟件進行分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，多組均數比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠24 h尿蛋白、生化指標 0周模型組及各干預組24 h尿蛋白定量均顯著高于正常對照組（P＜0.01）。4周時模型組24 h尿蛋白顯著高于正常對照組，不同濃度青藤堿干預后均有下降，尤其是青藤堿中、高劑量組較為明顯（P＜0.05）；血白蛋白經青藤堿干預后有所上升，亦以青藤堿中、高劑量組上升較明顯（P＜0.05）；FK506組療效與青藤堿高劑量組相似。與正常對照組比較，模型組血肌酐顯著上升（P＜0.05），經不同劑量青藤堿干預后及FK506干預后，較模型組有所下降，但無顯著差異。見表1。

表1 各組24 h尿蛋白定量、血白蛋白和血肌酐水平（±s）

表1 各組24 h尿蛋白定量、血白蛋白和血肌酐水平（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別24 h尿蛋白定量（mg/d）（0周）24 h尿蛋白定量（mg/d）（4周）血白蛋白（g/L）（4周）血肌酐（μmol/L）（4周）正常對照組2.42±0.512.56±0.2830.05±0.8536.78±8.29模型組149.29±49.06*187.91±26.74*13.63±1.38*117.47±34.80*青藤堿低劑量組131.33±51.25*158.59±45.06*15.03±3.00*115.25±23.24*青藤堿中劑量組112.01±46.48*147.89±36.06*#16.32±2.08*#112.22±21.18*青藤堿高劑量組122.63±42.18*143.23±38.52*#18.28±2.49*#112.37±17.86*FK506組135.23±51.26*134.53±14.85*#19.40±1.84*#95.21±16.55*

2.2 腎組織病理形態學變化 （1）各組大鼠腎組織病理變化：PAS染色顯示，正常對照組大鼠腎小球血管袢開放良好，腎小管結構正常。模型組大鼠部分腎小球局灶節段硬化，球囊粘連，系膜基質增多，腎小管變形，腎小管上皮細胞脫落。青藤堿低劑量組病變也較明顯，部分腎小球血管袢發生節段硬化，球囊粘連。青藤堿高劑量組腎小球/小管病變較模型組顯著改善。FK506對照組有輕度的腎小球增大，但也較模型組顯著改善（圖1）。（2）腎組織Podocin、TRPC6免疫組化：模型組大鼠腎組織中Podocin的表達顯著減少（P＜0.05），青藤堿低、中、高劑量組Podocin的表達逐步增高，FK506組的Podocin表達也有所升高（圖2）。模型組TRPC6的表達較正常對照組顯著升高（P＜0.05），青藤堿低、中、高劑量組TRPC6表達逐步減少，FK506組的TRPC6表達也較模型組下降，與青藤堿高劑量組相仿（圖3）。（3）各組大鼠腎組織電子顯微鏡分析：與正常對照組比較，模型組腎小球基底膜呈節段增厚，足突彌漫融合。青藤堿低劑量組、青藤堿中劑量組仍有足突廣泛融合，青藤堿高劑量組及FK506組足突融合程度明顯降低（圖4）。

圖1 各組大鼠腎組織病理變化（PAS ×400）。A.正常對照組，B.模型組，C.青藤堿低劑量組，D. 青藤堿中劑量組，E.青藤堿高劑量組，F. FK506組

圖2 各組大鼠腎組織Podocin表達（PAS×400）。A.正常對照組，B.模型組，C.青藤堿低劑量組，D.青藤堿中劑量組，E.青藤堿高劑量組，F. FK506組，G.各組的Podocin的相對表達量。與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

圖3 各組大鼠腎組織TRPC6表達（PAS ×400）。A.正常對照組，B.模型組，C.青藤堿低劑量組，D. 青藤堿中劑量組，E.青藤堿高劑量組，F. FK506組，G.各組的TRPC6的相對表達量。與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

圖4 各組大鼠腎組織電鏡形態學改變（×10,000）。A.正常對照組，B.模型組，C.青藤堿低劑量組，D.青藤堿中劑量組，E.青藤堿高劑量組，F. FK506組

2.3 各組腎組織中Nephrin、 Podocin、TRPC6表達水平 與正常對照組比較，模型組大鼠Nephrin、Podocin表達顯著下降（P＜0.05）。經不同濃度青藤堿干預后，Nephrin、Podocin的表達較模型組有所升高，其中青藤堿高劑量組Nephrin表達顯著升高（P＜0.05），青藤堿中、高劑量組的Podocin顯著升高（P＜0.05）。FK506組的Nephrin，Podocin表達較模型組有所升高。與正常對照組比較，模型組大鼠TRPC6表達顯著上升（P＜0.05），青藤堿低、中、高劑量組TRPC6表達逐步下降（P＜0.05），FK506組的TRPC6表達較模型組顯著下降（P＜0.05），青藤堿高劑量組接近FK506對TRPC6的下調作用（圖5）。

圖5 免疫印跡檢測各組Nephrin，Podocin，TRPC6。A.從左到右為正常對照組、模型組、青藤堿低劑量組、青藤堿中劑量組、青藤堿高劑量組、FK506組；B.Nephrin的表達分析；C. Podocin的表達分析； D.TRPC6的表達分析。與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

3 討論

FSGS病理特征為腎小球局灶節段硬化，足突彌漫融合。TRP通道是細胞膜上重要的非選擇性陽離子通道。其中TRPC6表達于足細胞［2］，與Nephrin、Podocin形成裂孔膜復合體，直接/間接地參與足細胞間的信號傳導和穩定骨架結構等功能［3］。TRPC6鈣離子內流增加升高細胞內鈣離子，可致足細胞分子表達異常，促使足細胞分離致FSGS。已知特發性FSGS患者足細胞TRPC6表達顯著增加［12］，將TRPC6基因轉染至小鼠腎，發現TRPC6主要位于足突，并致蛋白尿。新近發現足細胞TRPC6介導的Ca2+內流導致calpain-1激活，Talin-1下調，從而造成足細胞損傷致FSGS［13］。可見TRPC6的表達升高與FSGS相關。已知阿霉素腎病大鼠TRPC6表達增高［14］。

已知中藥成分可通過抑制TRPC6足細胞［15］，青藤堿可減少動物關節炎模型關節中的炎細胞浸潤［5］，已有報道以青藤堿干預系膜增生性腎炎、IgA腎病、糖尿病腎病，可減少尿蛋白［16］。青藤堿還可通過上調Nephrin及Podocin減少Heymann大鼠的尿蛋白。還發現青藤堿可下調多種細胞鈣離子內流［6-8］，如通過抑制Ca2+通道，激活內皮細胞中NO和前列腺素（PG）I2合成而舒張血管［6］；降低巨噬細胞內鈣離子水平，激活JAK2/STAT3通路抑制炎癥反應等。

由此作者推測青藤堿也可能通過干預足細胞TRPC6干預FSGS。結果表明青藤堿能劑量依賴性減少阿霉素腎病大鼠的尿蛋白，升高血白蛋白。而高劑量青藤堿作用與鈣調蛋白抑制劑FK506相當。青藤堿干預能劑量依賴性下調阿霉素腎病大鼠足細胞TRPC6表達，上調Nephrin、Podocin表達，提示青藤堿可能通過下調TRPC6表達，減少鈣離子內流，進而上調Nephrin，Podocin表達，而干預FSGS。其中青藤堿高劑量組接近FK506對TRPC6的下調作用［11］，提示高劑量青藤堿可能通過下調TRPC6達到近似FK506的保護足細胞而減少尿蛋白。

綜上所述，青藤堿可能通過下調TRPC6表達對足細胞損傷進行修復，減少尿蛋白排泄，進而減輕腎損傷。