結直腸癌篩查人群血漿游離DNA濃度及其對甲基化篩檢技術的影響

鄭衛方 柴曉銀 潘富珍 徐美慧 章喆 藍柳豪 黃彥欽 鄭樹

自2016年美國FDA批準SEPT9甲基化檢測（epiproColon）以來，血漿游離DNA已用于早期結直腸癌（colorectal cancer，CRC）檢測［1］。一項針對＞50歲無癥狀人群的SEPT9甲基化檢測研究發現，SEPT9甲基化檢測對CRC特異性高（91.6%），但敏感性低（48.2%），對進展期腺瘤的敏感性更低（11.2%）［2］。然而，另一項多中心研究報道SEPT9甲基化檢測CRC敏感性較高（73.3%），但特異性較低（81.5%）［3］。通過血液檢測進行CRC篩查具有易獲取性和便利性，但尚未廣泛應用于CRC人群篩查。美國最近發布的《2021年CRC篩查的預防服務工作隊建議聲明》未納入任何關于血液檢測的建議［4］。然而，有關sept9血液檢測和其他基于血漿cfDNA的檢測用于CRC篩查的案例不斷被報道［5］。探索基于cfDNA血液檢測用于人群篩查具有一定的意義。對基于cfDNA血液檢測原理的研究表明，血漿樣品中cfDNA濃度可能對成功檢測起著重要作用，尤其是對于那些以DNA甲基化標記物為目標檢測。提示血漿樣本中cfDNA濃度越高，樣本中存在游離腫瘤DNA（ct DNA）的幾率越高［6］。對于甲基化檢測，亞硫酸氫鹽轉化是不可避免的，亞硫酸氫鹽轉化會損傷大部分DNA。較高的cfDNA濃度意味著較少的轉換DNA損失，從而導致成功的甲基化檢測。但CRC篩查人群血漿cfDNA濃度的研究鮮有報道。本研究利用一個社區人群結直腸癌篩查采集的樣本，對人群血漿cfDNA濃度特征，血漿cfDNA定量對風險模型預測進展期結直腸腫瘤的影響開展研究。

1 資料與方法

1.1 研究設計 本研究基于浙江省蘭溪市正在進行的一項結直腸癌篩查項目，于2020年3月至2022年12月招募該地區居住居民40～74歲人群。簽署研究知情同意書后，每位參與者均需要進行面對面的問卷調查和抽血。血液容器為4 mL EDTA抗凝管（BDvacutainer，美國）。從管中取出所有血漿存放于-80 ℃冰箱中備用。篩選程序和實驗室檢測均獨立進行，排除拒絕結腸鏡檢查、腸道準備極差（波士頓評分＜6分）、家族性腺瘤性息肉綜合征者。本研究在《赫爾辛基宣言》的約束下，經蘭溪市人民醫院機構審查委員會審查通過。

1.2 篩查程序 研究參與者首先進行問卷調查和糞便免疫化學檢測（FIT）。問卷調查要求個體詳細回答當前胃腸道癥狀。常見慢性病史、腫瘤家族史、吸煙/飲酒/運動習慣、結腸鏡檢查史、胃腸道疾病史。問卷結束后兩周完成糞便檢測，此后指導所有參與者接受結腸鏡檢查。結腸鏡檢查由蘭溪市人民醫院經驗豐富的內鏡醫師完成。按照中華醫學會內鏡學分會指南記錄腸道準備質量、盲腸插管情況及腸鏡下病變情況。所有結腸鏡下的息肉和平坦型病變均需至少活檢進行組織學檢查。若病灶被切除或引入外科學，腹腔鏡活檢診斷則由大樣本的病理診斷代替。進展期腺瘤定義為直徑≥10 mm的腺瘤，或腺瘤伴高級別異型增生，或腺瘤絨毛狀形態大于顯微鏡視野25%。進展期腫瘤被定義為CRC和進展期腺瘤的組合。

1.3 實驗方法 抽血后4 h內，先將試管以1,000 g離心10 min，然后將血漿轉移至干凈的塑料管中，于-80 ℃冷凍。血漿樣本cfDNA的提取采用cf - NucXtractBlood Kit試劑盒，操作步驟參照文獻［7］。該試劑盒不使用載體RNA，可以更準確地測定cfDNA的純度。在Qubit3.0儀器中用QubitdsDNA HS Assay Kit（Life Technology，USA，cat.123456）提取后立即測定DNA濃度。對于所有濃度較高（＞ 20 ng/mL血漿）的cfDNA樣本，采用Q-sep100進行毛細管電泳，排除基因組DNA污染。其余cfDNA均經Zymo Gold甲基化試劑盒（ZYMO，美國，cat）處理。取一半轉化后的DNA在30 μLPCR體系中進行Methy Light檢測［8］。MethyLight靶向SEPT9和C9ORF50的啟動子區域，以β-肌動蛋白為參照。SEPT9所用PCR引物為上游引物5’-CGGAGCGTTCGTATTTTCGT-3，反向引物：5’-ACTTCCCAATCCCGAATCCG-3’為；C9ORF50上游引物5’-GCGTTCGACGTTTATTTCGG-3’，5’CGC GACTACCCAAACTAACC-3’為反向引物；beta-actin上游引物5’-TAGGGTTTGAGGATTTTTGGTTGT-3’，5’-CCCAACACCACACTCTACCT-3’為反向引物以目的基因的Ct值減去β-肌動蛋 白的Ct值計算Ct值差值。如果cfDNA樣品的SEPT9或C9ORF50的Ct值差值低于7，則cfDNA樣品經甲基化分析檢測為陽性，即在加標樣品中實驗確定的。

1.4 統計學分析 采用STATA15.0和Graphpad prism 9軟件。簡單率用于報告研究人群的特征。率的置信區間（CI）采用Exact（克洛珀-Pearson）檢驗。采用單側Fisher ' s Exact檢驗風險比差異的顯著性。不同組間cfDNA濃度的差異采用t檢驗進行分析，風險預測模型的構建采用概率估計法，即利用Logistic回歸中的系數。生成風險預測模型用受試者操作曲線。曲線下面積差異采用De Long法進行檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究人群特征及篩查診斷結果 本研究共招募606例同意參與者，在篩查結束時，排除122例未能接受結腸鏡檢查和5例腸道準備較差者，研究最終納入479例，人群平均年齡為（62.02±7.24）歲，男性略多于女性。經結腸鏡檢查及病理診斷，確診（12.11%，95% CI：9.32～15.37）進展期腫瘤58例。僅發現5例（1.04%，95% CI：0.34～2.42）CRC患者。研究人群特征及篩查診斷結果見表1。

2.2 人群特征亞群血漿cfDNA濃度 所有血漿樣本均成功提取cfDNA，人群血漿cfDNA濃度見圖1。所有個體的cfDNA平均濃度為（10.58±1.45）ng/mL plasma。但cfDNA濃度較高的樣本分布呈高度偏態分布。cfDNA濃度為25、50、75、90和個體95百分位數分別為5.20（95%CI：4.88～5.44）ng/mL血漿、7.08（95% CI：6.81～7.41）ng/mL血漿、9.54（95% CI：8.94～10.32）、13.08（95% CI：11.90～14.97）ng/mL血漿和18.60（95%CI：15.49～25.92）ng/mL血漿。cfDNA含量最高的10個個體的血漿cfDNA平均濃度為（139.97±57.90）ng/mL plasma。約為其余個體［（7.8165±4.416）ng/mL血漿］的18倍。濃度較高的cfDNA均未受到基因組DNA的嚴重污染。在cfDNA濃度最高的10名個體中，平均年齡為（62.6±6.42）歲，平均BMI為（23.11±3.24），其中男性6例，晚期腺瘤1例，高血壓3例，高血脂2例，糖尿病1例，腹痛1例，排便異常1例，吸煙者4例，日常積極鍛煉者4例。

圖1 人群特征亞群血漿cfDNA濃度

2.3 常見病人群亞群cfDNA濃度和有無cfDNA濃度的晚期結直腸癌風險預測模型的受試者操作曲線下面積 圖2和圖3用均值及其95% CI描繪cfDNA濃度在不同組個體中的分布。cfDNA濃度在有、無該特征組之間差異有統計學意義的僅見于主訴腹痛組和高脂血癥組。診斷為進展期腫瘤和無進展期腫瘤的個體組間cfDNA濃度無差異。此外，5例CRC患者的cfDNA濃度（均值=6.82 ng/mL血漿）均未升高。cfDNA濃度截斷值和未截斷值的甲基化檢測結果對研究人群血漿cfDNA甲基化檢測結果為陽性的（11.90%，95% CI：9.14～15.14）個體有57例。在這些個體中，SEPT9檢測陽性的有50個，C9ORF50檢測陽性的有12個，兩個基因均為陽性的僅有5個。甲基化檢測對進展期腫瘤的陽性預測值為19.3（95% CI：9.1～29.5）。5例CRC患者中有2例檢測陽性。見圖2。

圖2 常見病人群亞群cfDNA濃度

圖3 有無cfDNA濃度的晚期結直腸癌風險預測模型的受試者操作曲線

2.4 有無cfDNA濃度切斷時甲基化檢測對晚期結直腸腫瘤的診斷效果 表2為cfDNA濃度截斷值和未截斷值時甲基化檢測對進展期腫瘤的診斷性能。似乎預測進展期腫瘤的甲基化檢測能力較低，不需要設定甲基化檢測的cfDNA濃度臨界值。有、無cfDNA濃度的風險預測模型性能利用logistic回歸中的多因素系數建立進展期腫瘤的風險預測模型。一個模型（納入模型）包括年齡、性別、BMI、FIT結果、CRC家族史、糖尿病、吸煙、息肉史、甲基化檢測結果、cfDNA濃度等。除cfDNA濃度外，其他模型（排除模型）均包含相同因素。生成這兩個模型預測進展期腫瘤風險的受試者工作曲線。納入模型和排除模型的曲線下面積分別為0.581（95%CI：0.49～0.672）和0.579（95% CI：0.488～0.670）。兩者的預測能力無顯著差異（P=0.4663）。見圖3。

表2 有無cfDNA濃度切斷時甲基化檢測對晚期結直腸腫瘤的診斷效果

3 討論

血漿cfDNA是結直腸癌術后監測復發和早期診斷液體活檢的主要來源。抽血篩查CRC方便［9］。近年來，cfDNA在癌癥早期診斷領域取得突破性進展［10］。然而，在缺乏證據支持其在人群篩查中的應用方面仍存在爭議。本研究重點是cfDNA濃度，以了解cfDNA定量是否有助于改進基于cfDNA甲基化標志物檢測篩查技術的篩查效果。提取479例個體血漿cfDNA，測定cfDNA濃度。分別建立有cfDNA濃度和無cfDNA濃度的風險預測模型。分析有、無cfDNA濃度截斷值的甲基化檢測的診斷性能。然而，最終在看似正常的研究人群中發現了血漿cfDNA濃度的偏態分布。少數個體cfDNA濃度較高，無明顯臨床特征。風險預測模型受試者工作曲線下面積（AUC）的比較，以及有、無cfDNA濃度甲基化檢測的診斷性能均無差異。提示cfDNA定量用于CRC人群篩查是不必要的。血漿cfDNA是從血漿樣品中提取的總DNA材料的統稱。將其應用于癌癥檢測時，檢測的實際靶標是無細胞腫瘤DNA（cell-free tumor DNA，ctDNA），ctDNA被認為是cfDNA的一部分。由于血漿樣品中cfDNA和ctDNA之間的關聯難以界定，因此，在檢測前通常關注cfDNA濃度而非ctDNA濃度。JIN等［11］開發了用于結直腸癌術后監測的多標志物甲基化檢測。cfDNA濃度的最低要求為每樣本5 ng。ZHANG等［12］開發了四標記甲基化檢測用于結直腸癌的早期檢測。所需的cfDNA濃度為每樣品10 ng。如果濃度較高的cfDNA樣本未受到基因組DNA的污染，那么可以認為濃度越高，檢測成功的可能性越高。然而，本研究未能發現這一假設的任何支持。cfDNA濃度可能與轉移性結直腸癌有關，但其對結直腸癌早期檢測的意義可能并不相同。癌癥患者、急性心臟病患者和劇烈運動后個體的血漿cfDNA濃度會顯著升高［6］。但人群血漿cfDNA濃度的研究鮮有報道。根據作者經驗，由于未知原因，血漿cfDNA濃度的增加可能是隨機產生的。這需要對cfDNA在人體內的動態進行深入探索。進展期腺瘤是除CRC外人群篩查的首要目標。本研究中的篩查結果反映了社區人群中結直腸腫瘤性病變的自然分布。進展期腺瘤占全部進展期腫瘤的91.2%。多因素風險預測模型對進展期腫瘤的預測能力較弱（AUC=0.581）。在特異性為90%時，其僅能識別18.97%的進展期腫瘤和一個CRC。在模型中加入cfDNA濃度對預測結果無影響。預測人群中的進展期腺瘤是困難的。FIT和血液檢測對進展期腺瘤的敏感性均較低［13］。FIT-DNA被報道具有更好的敏感性，但特異性顯著降低［14］。亞太地區結直腸評分中使用因子的遺傳風險預測模型與作者的預測能力相似（AUC=0.60）［15］。加入BMI后，AUC增加至0.65。另一項來自韓國的研究觀察到一種新的進展期腫瘤風險預測模型的指數（AUC=0.726）更高［16］。

通過甲基化檢測進一步驗證cfDNA濃度對群體篩選的影響。SEPT9基因和C9ORF50基因的啟動子區域進行甲基化檢測。SEPT9是一個成熟和公開驗證的標記。C9ORF50由LANGE等于2012年首次報道［16］。在本研究之前對CRC組織DNA中的甲基化標志物進行篩選時，C9ORF50的表現優異。有研究發現通過cfDNA和糞便DNA預測CRC具有巨大的潛力［17］。然而，作者發現通過血漿cfDNA聯合SEPT9和C9ORF50甲基化檢測對進展期腫瘤的預測能力仍較差。5例CRC中2例被成功檢出，但漏診了大部分進展期腺瘤。遺憾的是，cfDNA濃度仍不影響預測甲基化檢測的能力。

本研究存在一些不足。首先，研究人群規模不足以發現更多的CRC病例。本研究中5例結直腸癌患者的cfDNA濃度（平均血漿6.82 ng/mL）較低，表明人群篩查中不需要進行cfDNA定量。更多的CRC患者必將使結果更可信。其次，本研究是基于正在進行的CRC篩查項目進行的。在該計劃中，CRC高風險的個體被要求完成結腸鏡檢查。導致在本研究中高風險個體的參與率高于低風險個體。因此，在本研究中，進展期腫瘤的檢出率略高于平均風險人群。這可能會使遺傳風險預測模型的準確性降低。第三，本研究中使用的甲基化檢測試劑盒是自主研發的，而不是FDA認證的epi-proColon試劑盒。本研究中描述的甲基化檢測的診斷參數僅適用于自建試劑盒。其只用于檢測cfDNA濃度的影響，不用于評估甲基化檢測的性能。

最后，血漿cfDNA作為液體活檢的重要靶點，在許多疾病的無創診斷中仍備受關注。盡管本研究結果未能支持血漿cfDNA定量作為晚期結直腸腫瘤早期診斷的重要因素，作者仍將血漿cfDNA作為潛在有用的標志物，但人體對血液中高濃度的cfDNA的耐受性還有待進一步研究。當知曉血漿cfDNA在血液中的動態時，可能有助于理解如何使用它。