基于網絡藥理學和分子對接探究枸杞子治療膝骨關節炎的潛在作用機制

劉艷霞，徐創龍，原淳淳，索文棟，楊景科，唐德志，徐浩

1.寧夏回族自治區中醫醫院暨中醫研究院，寧夏 銀川 750021；2.上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 200030

膝骨關節炎(knee osteoarthritis，KOA)是以關節軟骨退變、骨質增生、軟骨下骨病變、滑膜炎癥等病理改變的一種慢性退行性關節疾病[1-2]，可引起疼痛、關節活動受限，嚴重時可致膝內翻或膝外翻畸形，從而降低患者生活質量。由于膝關節解剖結構和功能結構的特殊性，KOA在全世界291種致殘疾病中排名第11位[3]。目前KOA的發病機制不清楚，臨床主要治療方法為口服藥物治療。長期口服非甾體類藥物等對人體具有較大的副作用，如引起消化性潰瘍等，而中藥在治療本病時具有簡、效、廉等特點，且歷史悠久，經驗豐富，能更好地改善KOA 患者癥狀[4]，從而明顯提高患者的生活質量。在中醫理論中，KOA 多歸屬“膝痛”“骨痹”等范疇，《黃帝內經》指出“痛在骨，骨重不可舉，骨髓酸痛……名曰骨痹”，骨痹發生于筋骨關節，發病的主要病機是“腎氣衰弱，寒濕入骨”，根據“腎主骨”“肝主筋”“脾主肌肉”的理論，確立了從肝腎脾論治骨痹的治則。有研究發現在治療“骨痹”的用藥規律中[5-6]，以肝腎虧虛為“骨痹”的發病根本，從“虛而補之”為根本治則，多選用歸肝、腎、脾經的藥物。

枸杞子(Lycii Fructus)為常用中藥材之一，用藥歷史悠久，其為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarumL.的干燥成熟果實。在《2020中國藥典》中記載，枸杞子歸肝、腎經，具有滋補肝腎、益精明目等功效。研究顯示枸杞子中含有多糖、黃酮類、萜類、生物堿等多種生物活性成分，具有抗氧化、調節免疫、抗炎、抗衰老、抗腫瘤、改善骨質疏松等藥理活性[7]，是珍貴的藥食兩用植物資源。因此本研究通過構建“藥物-成分-靶點-通路-疾病”網絡，從而預測枸杞子治療KOA的有效成分及其作用機制，為后續研究枸杞子活性成分的作用于KOA的作用機制以及治療KOA的藥物的研發提供參照。

1 材料與方法

1.1 枸杞子藥物有效成分及靶點的獲取 通過在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺2.3(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且類藥性指數(drug likeness，DL)≥0.18 獲取枸杞子有效活性成分及各成分對應的體內作用靶點蛋白，將靶點蛋白輸入Uniprot 蛋白質數據庫中(數據收集截止日期2022-08)，篩選條件為“Reviewed”，限定物種為“Human(人)”，合并后刪除重復基因，保留唯一值，最終得到枸杞子活性成分的候選靶標對應的基因名。

1.2 枸杞子-活性成分-作用靶點網絡構建 將1.1 收集到的將枸杞子活性成分及其體內作用的靶點導入Cytoscape 3.9.1軟件，構建“枸杞子-活性成分-靶點”網絡圖。

1.3 枸杞子治療膝骨關節炎預測靶點的篩選 以“knee osteoarthritis”OR“KOA”作為檢索詞，分別利用Gene Cards 數據庫(http://www.genecard.org)和OMIM數據庫(https://www.omim.org/)來獲取膝骨關節炎的疾病相關基因，根據score 篩選KOA 相關靶點。將疾病靶點與藥物靶點導入微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)數據分析平臺繪制Venny圖，確定枸杞子治療KOA的作用靶點。

1.4 枸杞子治療膝骨關節炎靶點網絡的構建 將“1.1”項下獲得的枸杞子活性成分與1.3中枸杞子治療KOA 作用的潛在靶點導入生物信息分析軟件Cytoscape 3.9.1，構建“枸杞子-主要活性成分-疾病靶點”網絡圖。

1.5 蛋白相互作用(PPI)網絡構建及核心靶點篩選 將1.3 項下所獲共同靶點上傳至String (https://string-db.org/)平臺構建枸杞子治療KOA 的PPI 網絡。將所獲相關tsv 格式數據導入Cytoscape 3.9.1 軟件進行拓撲屬性分析，構建“枸杞子治療KOA核心靶點”關系網絡圖。

1.6 分子對接預測活性成分與膝骨關節炎的核心靶點基因結合活性 在Cytospace 3.9.2 中構建“藥物-疾病-靶點”的作用網絡，將枸杞子發揮治療KOA的關鍵靶點及活性成分進行分子對接實驗，驗證其相互作用活性。根據Degree值由高到低進行排序，然后利用TCMSP數據庫下載的枸杞子發揮治療KOA主要的3 個活性成分三維分子結構，通過PCSB PDB 數據庫(https//www.rcsb.org/)下載枸杞子發揮治療KOA 的關鍵靶點蛋白分子下載，并根據分子對接蛋白結構六大原則進行篩選，最終獲取可靠性最高的蛋白結構并下載PDB Format 格式，利用StoneMIND Collector 軟件進行結構識別和修飾，利用Discovery Studio Client 2019進行生物學驗證對接。

1.7 核心靶點GO 富集分析及KEGG 信號通路富集分析與可視化 利用生物學信息注釋數據庫6.8(the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID，https://david.ncifcrf.gov/)對枸杞子潛在治療KOA 靶點進行GO (Gene Ontology)及KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號通路富集分析，篩選前五個具有顯著性差異的GO和KEGG數據予可視化處理。

2 結果

2.1 枸杞子有效活性成分篩選結果 通過檢索和篩選后共獲取枸杞子有效活性成分共36 個(表1)。通過Uniprot數據庫，將有效成分的靶標名稱轉換為人源基因并刪除重復基因后獲得203 潛在作用靶點，即得枸杞子活性成分體內作用靶點。

表1 枸杞子有效活性成分Table 1 Effective active ingredients of Lycii Fructus

2.2 枸杞子-活性成分-作用靶點網絡構建 收集到的枸杞子活性成分體內作用靶標導入Cytoscape 3.9.1 軟件，構建“枸杞子-活性成分-靶點”網絡圖(圖1)。該網絡共包括240個節點，其中中心的黃色節點代表枸杞子，36 個橙色節點代表枸杞子的活性成分，203 個綠色節點代表枸杞子活性成分體內發揮作用的相關靶點，394 條邊代表枸杞子活性成分與相關的靶點的相互作用。其中槲皮素的節點值最大(Degree值為152)，說明其可能是枸杞子在體內發揮疾病治療作用的關鍵有效成分。

圖1 枸杞子-活性成分－靶點網絡圖Figure 1 Lycii Fructus-active ingredients-targets network diagram

2.3 枸杞子有效活性成分治療膝骨關節炎作用靶點預測及篩選 通過Gene Cards 平臺與OMIM 數據庫共獲取KOA 疾病相關靶點基因有2 303 個，以Relevance score≥2.687作為篩選條件后，獲得577個靶點基因。然后將枸杞子主要活性作用靶點與KOA 疾病靶點進行映射后獲得66靶點基因，即為枸杞子治療KOA的潛在作用靶點，見圖2。

圖2 枸杞子主要活性成分靶點與膝骨關節炎靶點Venn圖Figure 2 Venn diagram of the target of main active ingredient of Lycii Fructus and target of knee osteoarthritis

2.4 枸杞子藥物-活性成分-膝骨關節炎靶點網絡圖構建 將“2.3 中得到的共同靶點對應上活性成分，制Excel表格，將該表導入Cytoscape3.9.2中，繪制得到枸杞子藥物-活性成分-疾病靶點網絡圖(圖3)，該網共有79個節點，其中黃色節點代表枸杞子，12個橙色節點代表枸杞子的有效活性成分(36個有效成分中有24個無治療KOA的作用)，66個藍色節點代表枸杞子有效成分治療KOA關鍵靶點，102條邊代表枸杞子活性成分與疾病之間的相互作用。度值越高，則節點顏色越深，靶點越重要，其中槲皮素(quercetin)的節點值最大(Degree=60)，其次為β-谷甾醇、黃豆黃素(Degree 值均為11)，其中槲皮素作用于59個疾病靶點，主要作用于PTGS2、PTGS1、PLAU、PIK3CG、BCL2、BAX、JUN、CASP3、TGFB1、PON1、AR、PPARG 等(列舉Degree≥2)，說明槲皮素在枸杞子治療KOA中起關鍵作用。

圖3 枸杞子藥物-活性成分-膝骨關節炎靶點網絡圖Figure 3 Network diagram of Lycii Fructus-active ingredients-tar gets for knee osteoarthritis

2.5 枸杞子治療膝骨性關節炎作用靶點PPI網絡及核心靶點 將枸杞子治療KOA疾病潛在66個靶點輸入String平臺，構建枸杞子治療KOA靶點相互作用網絡(PPI)，PPI網絡(圖4)中包含66 個節點和272 個相互作用(連線)。網絡平均度值為33.4，平均聚集系數為0.784，P值：＜1.0e-16。將獲得的相關tsv 格式數據導入Cytoscape3.9.2軟件進行網絡拓撲分析，如圖5所示，圓形圖標則代表核心靶點。這些靶點中度值越高，則節點顏色越深，靶點越重要，度值排名靠前的靶點(列舉前10 個核心靶點，見表2)有腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素-6(IL-6)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、細胞腫瘤抗原p53 (TP53)、基質金屬蛋白酶9 (MMP9)、重組人胱天蛋白酶3(CASP3)、前列素G/H合成酶2(PTGS2)、c-Jun氨基端激酶(JUN)、表皮生長因子(EGF)等，這10個關鍵靶點可能通過降低炎癥因子表達水平及調控骨細胞合成代謝的生物過程等在枸杞子治療KOA 作用機制中發揮關鍵作用。

圖4 枸杞子治療膝骨關節炎的PPI網絡圖Figure 4 PPI network diagram of Lycii Fructus in the treatment of knee osteoarthritis

表2 核心靶點的拓撲學參數信息Table 2 Topological parameter information of the core target

2.6 分子對接預測活性成分與膝骨關節炎的核心靶點基因結合活性 對圖3所示網絡圖進行分析，得到枸杞子治療KOA 主要活性成分(槲皮素、β-谷甾醇、黃豆黃素)，將這些成分與網絡中度值較高的核心靶點PTGS2、PTGS1、OPRM1進行分子對接分析(表3、圖6)。枸杞子主要活性成分與活性位點關鍵氨基酸殘基形成極性或非極性鍵，以穩定配體和受體的結合。枸杞子主要活性成分相互作用力分析結果顯示，主要活性成分通過范德華力、氫鍵、Pi 相互作用與關鍵靶點的活性位點相結合。

圖6 分子對接模式圖Figure 6 Molecular docking

表3 枸杞子治療膝骨關節炎主要活性成分及作用靶點Table 3 Main active ingredients and targets of Lycii Fructus in the treatment of knee osteoarthritis

2.7 枸杞子治療膝骨關節炎關鍵靶點基因GO和KEGG富集分析 利用DAVID數據庫對篩選所獲66個枸杞子治療KOA關鍵靶點基因進行GO-BP、GO-CC、GO-MF和KEGG富集分析。GO-BP、GO-CC、GO-MF分析均以P＜0.01條件進行篩選，按P值從小到大排序取前5條通路進行分析。生物過程(BP)分析中主要涉及基因表達的正向調控(positive regulation of gene expression)、炎癥反應(inflammatory respons)、藥物反應(response to drug)、細胞對脂多糖的反應(cellular response to lipopolysaccharide)等。細胞組分(CC)涉及細胞外空隙(extracellular space)、細胞外區域(extracellular region)、內質網(endoplasmic reticulum lumen)、細胞外基質(extracellular matrix)等。分子功能(MF)分析中主要涉及酶結合(enzyme binding)、絲氨酸蛋白酶肽鏈內切酶活性(serine-type endopeptidase activity)、相同的蛋白結合(identical protein binding)、細胞因子活性(cytokine activity)等(圖7)，由此推測出枸杞子的活性成分可能通過干預以上生物過程發揮治療KOA 的作用。KEGG富集的通路結果(圖8)顯示，枸杞子主要通過晚期糖基化終末產物-糖基化終末產物受體信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complication)、癌癥信號通路(pathways in cancer)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、脂質和動脈粥樣硬化通路(lipid and atherosclerosis)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)等信號通路發揮治療KOA 的作用。

圖7 枸杞子治療膝骨關節炎靶點GO分析Figure 7 GO analysis of target of Lycii Fructus in the treatment of knee osteoarthritis

圖8 枸杞子治療膝骨關節炎的靶點KEGG分析Figure 8 KEGG analysis of target of Lycii Fructus in the treatment of knee osteoarthritis

3 討論

本研究發現，枸杞子發揮治療KOA主要活性成分是槲皮素。有研究發現槲皮素可促進脂多糖誘導的軟骨細胞增殖，調控軟骨細胞外基質合成與代謝平衡，抑制炎癥反應，恢復軟骨細胞功能[8-11]。此外研究表明，局部炎癥因子釋放相關及軟骨細胞不能維持細胞外基質和軟骨下骨合成和降解之間的穩態，導致KOA 發生[12]。因此，枸杞子中發揮治療KOA 最主要活性成分為槲皮素，可能與調控軟骨細胞的代謝平衡、降低氧化應激反應、改善內環境的炎癥反應等機制密切相關。

本研究枸杞子藥物-活性成分-疾病靶點網絡圖和PPI結果表明，枸杞子中多種有效成分作用于TNF、IL6、AKT-1 關鍵靶點基因。TNF 和IL-6 是一種具有多功能的細胞因子，且參與炎性反應調節。研究發現TNF能促進膠原酶和前列腺素E2的產生及IL-6的分泌，可使軟骨及軟骨下骨結構改變、刺激軟骨細胞增殖，導致關節腫脹以及軟骨侵蝕等炎癥反應，加重KOA患者的臨床表現[13-16]。也有研究表明KOA患者關節損傷程度與血清中TNF-α、IL-6 水平顯著相關[17]。AKT1 參與調節新陳代謝、增殖、細胞存活、生長和血管生成等過程[18]，研究發現AKT1 參與軟骨內骨化過程，抑制骨贅的形成，還可以通過磷酸化使蛋白聚糖的合成增多，促進了人關節軟骨細胞的細胞活力[19-20]。因此可以推測枸杞子各成分主要作用于炎性反應調節、調控軟骨細胞的增殖、分化等相關的靶點發揮治療KOA。利用DAVID數據庫對枸杞子治療KOA關鍵靶標進行GO富集分析，研究顯示這些靶點與PPI網絡分析的規律相一致，也與KOA發病機制相符合。

KEGG信號通路富集結果顯示，枸杞子治療KOA核心靶點基因參與的多條信號通路，主要涉及晚期糖基化終末產物-糖基化終末產物受體(AGEs-RAGE)、癌癥、白介素17 (IL-17)信號通路等，其中AGEs-RAGE信號通路富集最顯著，AGEs 通過與受體RAGE 結合產生氧化應激反應，激活大量促炎癥細胞因子、生長因子和黏附分子等的表達和釋放，使軟骨細胞合成和分解代謝的失衡，進而調控細胞凋亡或存活、誘發炎癥反應等[21-23]。相關研究發現IL-17 作為一種重要的炎癥細胞因子，當KOA 關節液中IL-17 升高時，關節軟骨IL-17信號通路關鍵蛋白，最終激活NF-κB，啟動下游炎癥反應[24]。王國良[25]、馮方等[26]研究發現KOA患者的滑膜液和滑膜中的IL-17 水平增加且與KOA嚴重性呈正相關，并且發現通過抑制IL-17 及其受體的生物學效應時可減輕關節炎的滑膜炎性反應，調節IL-17 基因表達水平可能會減輕患者臨床癥狀。GO和KEGG富集結果表明，枸杞子治療KOA作用機制涉及多個生物學過程和多條重要的信號通路。

綜上所述，本研究通過構建“藥物-成分-靶點-通路-疾病”網絡，預測枸杞子治療KOA的主要活性成分為槲皮素，以TNF、IL-6、AKT-1 為關鍵靶點，可能通過調控軟骨細胞的代謝平衡、促進細胞增殖、分化、降低氧化應激反應、改善內環境的炎癥反應等機制，為枸杞子在臨床中作用于KOA 研究方面提供了方向和思路，但本研究通過調取相關數據庫對藥物的活性成分作用于疾病靶點及核心靶點基因參與的信號通路進行預測，仍存在一定的局限性，結論需進行后期實驗研究加以驗證。