枸杞多糖對絕經后骨質疏松患者腸道菌群結構及短鏈脂肪酸的影響*

卓嘉璐 李子祥 楊 寧 高明波 錢春花 韓 婷,#

絕經后骨質疏松癥(Postmenopausal Osteoporosis,PMO)是一類由雌激素缺乏引起的全身性代謝性骨病,其特征為進行性全身性骨密度降低和骨組織微結構改變,易引起骨折或全身骨痛,從而導致疼痛、畸形甚至死亡等不良臨床結局。據統計,我國25%-30%的絕經后婦女都患有骨質疏松癥,且其發病率呈逐年上升趨勢[1],嚴重損害了中老年婦女的身體健康及生活質量[2],現已成為亟待解決的臨床問題之一。腸道菌群被認為是機體一個重要的“特殊器官”,菌群種類的動態平衡和變化在維持人體健康中起著至關重要的作用[3]。近年研究表明,PMO患者的腸道微生物群組成發生變化,包括豐富度和多樣性下降、有益菌及致病菌比例失調等[4],認為腸道菌群失調與機體骨密度調控相關,可能是干預PMO的新靶點[5]。

益生元是一種由腸道菌群發酵、耐胃酸和水解酶而不被腸道消化吸收的食物成分。現有的證據表明,益生元對骨代謝具有調節作用,可使腸道菌群中的有益菌代謝更多的短鏈脂肪酸(Short-chain Fatty Acids,SCFAs),而SCFAs是破骨細胞新陳代謝和骨質的有力調節者[6]。益生元還可調節免疫系統,影響鈣吸收和轉化、促進骨的形成和骨礦化、增加骨密度,改善骨質疏松[7]。枸杞多糖(Lycium Barbarum Polysaccharides,LBPs)是一種潛在的益生元,有利于增強腸道微生物群的活性。已有研究表明枸杞多糖具備潛在益生元的作用,不僅能夠改善機體免疫功能及氧化應激引起的全身炎癥反應,而且還能通過其生物活性影響腸道菌群和代謝產物,在調節腸道微環境、改善宿主健康和靶向腸道效應方面具有積極影響[8]。但鮮有研究報道枸杞多糖在骨質疏松癥的預防和輔助治療中的作用,尤其是枸杞多糖對骨質疏松癥腸道微生態的系統性研究還缺乏相關數據。

人體腸道微生態系統模擬裝置(Simulator of Human Intestinal Microbial Ecosystem,SHIME@)是比利時根特大學設計的一套包含胃、小腸以及大腸的完整模擬消化系統,能夠有效模擬人體的消化及腸道微生態環境,是研究體外胃腸道不同部位對腸道菌群組成影響的有效工具。本研究擬應用SHIME@模擬人體消化系統,使用枸杞多糖對其進行干預,檢測并分析系統產出的發酵液,研究枸杞多糖對PMO患者腸道菌群及其代謝產物SCFAs的影響,從而進一步探討枸杞多糖對預防與治療骨質疏松的作用機理。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

枸杞多糖(上海源葉生物科技有限公司);標準品:乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、異丁酸、異戊酸(美國Sigma公司)。SHIME的營養培養基批號為PDNM001B(ProDigest,Ghent,Belgium),由阿拉伯半乳聚糖(1.2g/L)、果膠(2g/L)、木聚糖(0.5g/L)、葡萄糖(0.4g/L)、酵母提取物(3g/L)、蛋白胨(1g/L)、粘蛋白(2g/L)、L-半胱氨酸鹽酸鹽(0.5g/L)和淀粉(4g/L)組成。胰液含有碳酸氫鈉(12.5g/L)、牛膽汁(6g/L)、胰蛋白酶(0.9g/L)。

1.2 糞便供體

糞便供體為上海第十人民醫院進行住院治療的PMO患者3例,納入標準:(1)年齡60-75歲,絕經婦女;(2)近6個月內無抗生素治療史;(3)未接受過膳食補充劑(鈣、維生素D)、益生菌、益生元治療;(4)無慢性或自身免疫性疾病史(例如消化道疾病、腎臟疾病、肝臟疾病,心血管疾病、甲狀旁腺疾病)。本研究按照《赫爾辛基宣言》規定的指導方針進行,所有涉及人類受試者的程序均經上海第十人民醫院倫理委員會批準(批準文號:2020KT50),所有受試者在納入研究前均獲得書面知情同意。

1.3 糞便樣本的采集和處理

清晨采集患者的中間段新鮮糞便,盡量避免尿液、灰塵等污染。稱取新鮮糞便,加入厭氧磷酸鹽緩沖溶液(0.1M PBS,pH=7.4)配制成10%(w/v)的糞便懸液,渦旋儀上混勻5s,靜置10min后取上層溶液進行離心(4℃、1 000r/min、10min),收集離心后的上層溶液進行體外模擬發酵實驗。

1.4 SHIME@

使用SHIME@(ProDigest,University of Ghent,Ghent,Belgium)評估長期攝入枸杞多糖對腸道微生物群的影響。本研究使用Triple-SHIME設置,由三個獨立的SHIME@系統并行運行,每個系統包括三個連續反應器,分別為胃/小腸反應器(Stomach/Small Intestinal,ST/SI)、近端結腸(Proximal Colon,PC)和遠端結腸(Distal Colon,DC)反應器。PC和DC反應器保持恒定體積,分別為500ml和800ml,pH值控制在固定范圍內(PC為5.6-5.9和DC為6.6-6.9)。

實驗開始時,將糞便接種液(10% w/v)以5%(v/v)的體積分別接種于兩個結腸反應器。初始靜態發酵16h后,將140ml SHIME營養培養基(3次/天)和60ml胰液(3次/天)泵入ST/SI反應器中,然后將反應器內混合物泵入PC和DC,多余的液體被泵到廢液容器中。實驗期間所有反應器都是密閉的,在37℃下連續攪拌并用氮氣沖洗以保持厭氧環境。

SHIME@運行包括2個階段:第一階段為穩定期(S)。模型中添加營養培養基,經過兩周的時間(Sw1、Sw2),糞便微生物群適應兩個結腸區域的環境條件,并達到穩定狀態。第二階段為治療期(T),為期2周(Tw1、Tw2),在營養培養基中以10g/L的劑量添加枸杞多糖(根據前期團隊的劑量學研究結果,枸杞多糖添加量為10g/L時降解率最高)。從PC和DC反應器采集樣本,包括穩定期第2周(Sw2,Day14),治療期的第1周(Tw1,Day21)和第2周(Tw2,Day28),用于后續檢測。實驗設計見圖1。

1.5 SCFAs檢測

利用液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)檢測體外發酵液中SCFAs的濃度。(1)色譜條件:采用ACQUITY UPLCBEH C18色譜柱(2.1mm×100 mm,1.7μm,Waters,USA),柱溫40℃,流動相A為0.1%甲酸水溶液,流動相B為乙腈:甲醇(2∶1,v/v),進行梯度洗脫(0-2min,80%A; 2-8min,80%A-60%A; 8-9.5min,60%A-5%A; 9.5-10min,5%A-80%A),流動相流速為0.4ml/min,進樣量為2μl。(2)質譜條件:采用多反應離子監測(Multiple Reaction Monitoring,MRM),電噴霧離子源(ESI),正負離子模式,正離子噴霧電壓:5 500V;負離子噴霧電壓:4 500V,離子源溫度500℃,氣簾氣35psi,霧化氣50psi,加熱輔助氣60psi。(3)樣品處理:取100μl 1.4中采集的樣品至離心管中,加入150μl 50%乙腈水溶液,渦旋3min,離心(10min,4℃,12 000rpm),取80μl上清至離心管中,再加入40μl 200mM 3-NPH(50%乙腈水溶液配置,v/v)和40μl 120mM EDC-6%吡啶(50%乙腈水溶液配置,v/v),40℃下反應30min,反應后取150μl進行氮吹,150μl乙腈水溶液(1∶3)復溶,過濾(0.22μm的有機濾膜)后轉移到棕色進樣瓶,上機分析。分別配制乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、異丁酸、異戊酸標準品的系列濃度梯度,定量分析后繪制標準曲線,用于待測樣本SCFAs的計算。

1.6 16S rRNA基因測序和序列分析

采用DNA抽提試劑盒提取樣本的基因組DNA,利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度,以基因組DNA為模板,選取16S區域中V3-V4區作為擴增區域,使用帶barcode的特異引物,Takara公司的Tks Gflex DNA Polymerase進行兩輪PCR擴增,上游引物序列為5’-TAC GGR AGG CAG CAG-3’,下游引物序列為5’-AGG GTA TCT AAT CCT-3’。對PCR產物進行Qubit定量。根據PCR產物濃度進行等量混樣,使用Illumina MiSeq平臺進行高通量測序(上海歐易生物醫藥科技有限公司)。

由Illumina MiSeq平臺測序所得原始數據為FASTQ 格式。首先使用Cutadapt軟件對原始雙端序列進行去雜處理。然后使用DADA2將去雜處理后的雙端系列按照QIIME 2(2020.11)默認參數進行質量過濾,降噪,拼接及去嵌合體等質控分析,得到代表序列及ASV豐度表格,將所有代表性序列與Silva(version138)數據庫進行比對注釋。基于物種注釋結果,進行α-多樣性指數分析,包括Shannon指數、Simpson指數、Chao1指數和ACE指數等。α-多樣性分析是微生物多樣性分析中一個重要的組成部分,Chao1和ACE指數能夠反映菌群豐度,Shannon和Simpson指數則說明群落中個體分配的均勻度,即多樣性。采用Bray-Curtis的主坐標分析(Principal Co-ordinates Analysis,PCoA)對樣品間微生物群落的結構變異(β-多樣性指數)進行展示。

1.7 統計學處理

2 結 果

2.1 發酵液中的細菌物種鑒定及菌群結構分析

門水平群落結構面積圖如圖2所示。優勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidota)、變形菌門(Proteobacteria)及放線菌門(Actinobacteria)。經過枸杞多糖干預后,放線菌門的相對豐度呈降低趨勢,變形菌門的相對豐度呈上升趨勢,但由于患者間存在個體差異性,在患者3中尤為顯著。在科水平上,枸杞多糖降低了Lachnospiraceae和Ruminococcaceae的豐度(圖3)。

注:A、B和C分別代表三例患者樣本。A3、B3、C3:穩定期(Sw2)PC樣本;A4、B4、C4:穩定期(Sw2)DC樣本;A11、B11、C11:治療期(Tw1)PC樣本;A12、B12、C12:治療期(Tw1)DC樣本;A15、B15、C15:治療期(Tw2)PC樣本;A16、B16、C16:治療期(Tw2)DC樣本。

注:A、B和C分別代表三例患者樣本。A3、B3、C3:穩定期(Sw2)PC樣本;A4、B4、C4:穩定期(Sw2)DC樣本;A11、B11、C11:治療期(Tw1)PC樣本;A12、B12、C12:治療期(Tw1)DC樣本;A15、B15、C15:治療期(Tw2)PC樣本;A16、B16、C16:治療期(Tw2)DC樣本。

屬水平物種組成分布如圖4所示。3例患者個體差異較大,枸杞多糖干預對近端和遠端結腸的菌群結構影響較大,共有的菌屬主要為大腸-志賀氏桿菌屬、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、薩特氏菌屬、小桿菌屬。乳桿菌屬在患者3中顯著增殖,尤其在患者近端結腸中富集。

注:A、B和C分別代表三例患者樣本。A3、B3、C3:穩定期(Sw2)PC樣本;A4、B4、C4:穩定期(Sw2)DC樣本;A11、B11、C11:治療期(Tw1)PC樣本;A12、B12、C12:治療期(Tw1)DC樣本;A15、B15、C15:治療期(Tw2)PC樣本;A16、B16、C16:治療期(Tw2)DC樣本。

2.2 多樣性分析

即本研究圖5結果顯示,Good’s coverage指數趨近于1,說明測序深度已能覆蓋到樣本中的所有物種,結果準確可靠。如圖6所示,遠端結腸物種多樣性較近端結腸豐富,在枸杞多糖干預一周后,物種多樣性達到峰值,再隨著干預時間降低,然而組間各多樣性指數差異無統計學意義。β-多樣性分析顯示不同患者之間相互分離,說明組間微生物群的組成存在明顯差異性(圖7)。

圖5 Good’s coverage測序深度指數

A:Chao1指數;B:Shannon指數;C:Simpson指數;D:ACE指數。

圖7 β-多樣性PCA分析2.3 SCFAs含量變化分析

如表1所示,枸杞多糖治療后,SCFA水平升高。枸杞多糖治療均顯著提高了結腸區域的乙酸水平(P<0.05),且遠端結腸中的乙酸含量增加最為明顯。近端結腸和遠端結腸用枸杞多糖干預后丙酸水平顯著高于穩定期(P<0.05)。與穩定期相比,近端結腸和遠端結腸的丁酸水平顯著升高(P<0.05)。與穩定期相比,枸杞多糖使結腸中總SCFAs水平顯著升高(P<0.05)。

表1 枸杞多糖干預對近端和遠端結腸中各SCFAs含量的影響(mg/ml)

3 討 論

本研究使用的SHIME@人體腸道微生物生態模擬系統,是由比利時根特大學研制出來的一套包含胃、小腸以及大腸的完整模擬消化系統。此系統的設計著重于模擬結腸微生物群,具有穩定性好、采集樣品方便、節省時間等優點[10-12]。

腸道微生物群及其代謝產物(如短鏈脂肪酸)可維持骨骼健康和骨質量,其機制可能包括免疫作用、營養物質吸收、調節雌激素等[13]。鑒于過往研究已證實枸杞多糖在上消化道中是不可消化的,并且可以被腸道微生物利用[8]。且枸杞多糖的免疫調節作用已被廣泛認識,其機制可能為增強腸粘膜免疫屏障的完整性、調節腸道微生物群及其代謝產物等[14]。本研究發現,枸杞多糖影響PMO患者的腸道微生物群。通常來說,腸道菌群主要分為厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門,其中擬桿菌門和厚壁菌門占90%以上。干預前,患者的優勢菌門為厚壁菌門、變形菌門、及放線菌門。經過枸杞多糖干預后,整個微生物群落結構被調節,患者的放線菌門的相對豐度明顯減少,變形菌門的相對豐度相對增加。毛螺菌科(Lachnospiraceae)屬于厚壁菌門,屬于厭氧菌,在體外和動物實驗中發現,毛螺菌科通過使用膜錨定白介素-6(IL-6)受體降低腸道IL-6水平來抑制骨再生和重塑[15]。高劑量補充枸杞多糖顯著降低毛螺菌科的豐度,這與本研究結果一致[9]。Li等[16]發現毛螺菌科的豐度與骨密度及T-評分呈正相關。然而,不同研究報道了相互矛盾的結果,毛螺菌科與骨代謝的關系仍不一致,需要進一步功能研究來驗證[17]。

本研究發現α-多樣性指數差異無統計學意義,這與Li等[9]動物實驗報道的結果一致,枸杞多糖干預對腸道菌群多樣性和豐富度的影響不明顯。β-多樣性分析顯示不同患者之間相互分離,也進一步說明組間微生物群的組成存在明顯差異性。值得注意的是,在這一過程中,枸杞多糖使患者3的乳酸桿菌顯著增殖。雖存在個體差異性,但這些數據與其它研究發現的枸杞多糖可提高小鼠腸道中乳桿菌相對豐度的最新報道相是一致[18]。乳桿菌在增強腸道上皮屏障功能、刺激腸道上皮增殖和抑制先天性炎癥信號通路方面非常有效[19]。動物實驗表明,乳桿菌可改善骨的微結構及生物力學,并調節CTX-I、PINP、Ca及RANKL的表達,恢復Th17/Treg平衡,從而緩解卵巢切除大鼠的骨質疏松[20]。本研究中部分患者乳酸桿菌顯著增加,從一定程度上也提示在PMO女性患者中補充枸杞多糖可顯著減少骨質流失,但未來需更大規模的臨床試驗進一步驗證,并探討相關機制。此外,乳酸菌也可利用枸杞多糖產生 SCFAs[21]。SCFAs已被證明可調節全身骨量,可對炎癥反應產生影響,保護其免受病態骨質流失[22]。

為了進一步明確結果,本研究對腸道菌群的代謝產物也進行了分析。結果發現枸杞多糖的干預使腸道菌群代謝產物含量變化,具體表現為乙酸、丙酸、丁酸含量上升,而這些都是SCFAs的主要組成部分。SCFAs 是腸道細菌從未消化的碳水化合物中產生的重要代謝產物,最新研究也觀察到枸杞多糖的免疫調節作用通路背后的機制是潛在的免疫介導效應,通過調節腸道微生物群代謝產物[23]。其中,有研究證實,丁酸可使小鼠腸道和骨髓中調節性T細胞(Treg)增多,進而活化成骨細胞的Wnt信號通路,刺激骨生成[24]。乙酸是主要的 SCFAs,可被結腸上皮吸收,是骨、外周組織代謝的能量來源[25]。本研究觀察到,與穩定期相比,枸杞多糖被發酵成不同的 SCFAs,提高了結腸內容物和糞便中 SCFAs 的總濃度,這表明攝入枸杞多糖可能對骨健康有益。這也與先前的研究報道一致。多項研究表明,多糖可作為益生菌代謝過程中的碳源,并分解成單糖,為益生菌提供能量,可增加 SCFAs(如乙酸、丙酸和丁酸)的濃度[26]。

綜上所述,本研究使用SHIME@模擬人體胃腸道,運用10mg/ml枸杞多糖進行干預,發酵液分析結果顯示,枸杞多糖可能通過調整腸道菌群結構,促進SCFAs的生成,對骨健康產生一定影響,為臨床進一步研究提供了理論依據。