蘇州地區獻血者血小板HPA基因分型與CD36表型的研究

王儀含 何紅紅 金一鳴 段寶生 王玉玨 湯龍海

[摘 ? 要] ? 目的：進一步研究蘇州地區單采血小板獻血者HPA基因分型及其CD36抗原表型，為建立本地區血小板資料庫及提高臨床血小板輸注有效性提供依據。方法：采用多重熒光PCR法對564例單采血小板獻血者抗凝全血標本進行HPA-1～6，10，15，21基因分型檢測，酶聯免疫吸附試驗檢測血小板CD36抗原表達，借助流式細胞術對CD36陰性標本進行確認和表型分型。結果：564份標本中HPA-3、15基因型的雜合程度最高，其等位基因頻率分別為HPA-3a 0.594、3b 0.406、15a 0.5275、15b 0.4725。蘇州地區HPA-1a基因頻率與英國白人、美國黑人差異有統計學意義（P＜0.05），與南京、廣州、黑龍江差異無統計學意義（P＞0.05）；HPA-2基因頻率與廣州、美國黑人差異有統計學意義（P＜0.05）；HPA-3和HPA-15基因頻率與廣州、黑龍江差異有統計學意義（P＜0.05）。HPA-5基因頻率與南京、廣州、黑龍江差異無統計學意義（P＞0.05），與英國白人、美國黑人差異有統計學意義（P＜0.05）。CD36陰性標本12例（2.13%），其中1例為Ⅰ型CD36缺失，11例為II型CD36缺失。結論：蘇州地區單采血小板獻血者HPA基因型分布具有高度多態性，并存在種族和區域差異。

[關鍵詞] ? 單采血小板固定獻血者；人類血小板特異性抗原；CD36抗原；血小板無效輸注

[中圖分類號] ? R446.11 [文獻標志碼] ? B [DOI] ? 10.19767/j.cnki.32-1412.2023.03.017

血小板表面具有復雜的血型抗原，包括ABO系統抗原、人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）、人類血小板特異性抗原（human platelet antigen，HPA）、CD36（glycoprotein Ⅳ，GP Ⅳ）抗原以及其它一些糖蛋白抗原[1]。HPA抗原由血小板特有抗原決定簇組成，是存在于血小板膜糖蛋白上具有獨特遺傳多態性的蛋白分子[2]，它的多態性是由于單個堿基取代而導致相應氨基酸的改變而產生。利用HPA基因分型檢測，可進行同種型別血小板個體輸注，從而有效降低產生血小板抗體的幾率。血小板表面另一種重要的糖蛋白分子是CD36抗原，又名NaKa抗原，在亞裔人群中缺失頻率相對較高，而在高加索人群缺失率較低[3]。HPA和CD36抗原是除HLA外造成免疫性血小板輸注無效的重要因素。由于HPA基因多態性及CD36抗原缺失，患者在輸血、移植、妊娠等免疫刺激下，易發生同種免疫性反應，造成血小板輸注無效、胎兒/新生兒同種免疫性血小板減少癥、輸血后紫癜等[4]。因此，本文隨機選取2022年2—6月蘇州市中心血站單采血小板固定獻血者（捐獻血小板次數≥3次/年）564例，對蘇州地區HPA抗原基因分型和CD36抗原缺失頻率進行分析，以期為建立本地區血小板資料庫及提高臨床血小板輸注有效性提供重要依據。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 研究對象 ? 單采血小板固定獻血者（捐獻血小板次數≥3次/年）564例，男性541例，女性23例，年齡20～55周歲，平均34.7±7.5周歲。籍貫分布在江蘇省內各地區，均為漢族，本實驗獲蘇州市中心血站醫學倫理委員會批準。采集獻血者靜脈血5 mL，EDTA抗凝，放置-40 ℃冰箱保存，于2022年7月一次性完成全部檢測。

1.2 ? 試劑與儀器 ? DNA提取試劑盒（批號：MYYTW

9901，北京天根生化科技有限公司）；人類血小板特異性抗原基因分型檢測試劑盒（批號：202110A，江蘇偉禾生物科技有限公司）；人類血小板CD36抗原檢測試劑盒（ELISA法，中科院蘇州生物醫學工程技術研究惠贈）；PE熒光標記抗人CD36單克隆抗體、FITC熒光標記抗人CD14單克隆抗體、PE標記的抗人IgG抗體（批號：336206、325604、403503，Biolegend，上海達科為生物技術有限公司）；流式細胞儀（DxFlex，美國Beckman Coulter公司）。

1.3 ? 方法

1.3.1 ? DNA提取：取獻血者抗凝全血標本250 μL，按試劑盒說明書提取DNA，濃度為30～50 ng/mL，A260/A280值為1.6～2.0。

1.3.2 ? HPA基因分型：按照試劑盒說明書，配置混合母液，包含HPA主反應液3 ?μL、HPA酶混合液0.4 μL、滅菌水12.6 μL。于每個反應孔中加入16 μL混合母液和2 μL DNA，放入熒光定量PCR儀（CFX96，BIORAD）中檢測。根據HPA亞型探針熒光標識表，如擴增曲線正常且Ct＜32判斷相應的HPA亞型為陽性，無擴增曲線升起或Ct≥32判斷相應的HPA亞型為陰性，擴增曲線異常則需重新檢測。

1.3.3 ? 血小板CD36抗原檢測：采用ELISA法，向反應微孔板中加入待檢、陽性及陰性對照血小板懸液，按試劑盒說明書要求初篩獻血員血小板CD36表達。將ELISA法初篩陰性標本采用流式細胞術進行確認：取血小板懸液標記PE抗人CD36單克隆抗體，室溫避光孵育15～20 min，經洗滌、離心、重懸后用流式細胞儀檢測血小板表面平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI）。

1.3.4 ? 單核細胞表面CD36抗原檢測：對流式細胞術確認的血小板CD36陰性標本，進一步標記FITC抗人CD14單克隆抗體和PE抗人CD36單克隆抗體，檢測單核細胞CD36的表達，確認CD36缺失表型。

1.4 ? 統計學處理 ? HPA基因型頻率=統計陽性數（aa/ab/bb）/統計總人數（n），a基因頻率=（aa+ab/2）/n，b基因頻率=（bb+ab/2）/n，并作Hardy-Weinberg（H-W）平衡吻合度驗證；不配合率（MP）=2ab（1-ab）（a、b分別代表a和b的等位基因頻率）。與國內其他地區漢族人群HPA-1～6和HPA-15等位基因頻率比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。CD36的表達分析采用FlowJo V10軟件。

2 ? 結 ? ? ?果

2.1 ? HPA-1～6、10、15、21系統基因型及等位基因頻率 ? 在564例標本中HPA-10未檢出b等位基因，但發現HPA-3bb、HPA-15bb純合基因型。經χ2檢驗，該系統基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。見表1。

2.2 ? 蘇州地區HPA-1～6、15、21基因頻率與國內外其他地區的比較 ? 蘇州地區單采血小板獻血員HPA-1～6、15、21系統基因分布頻率與張若洋等[5]報道的結果比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；HPA-1a基因頻率與英國白人、美國黑人的差異有統計學意義（P＜0.05），與南京、廣州、黑龍江的差異無統計學意義（P＞0.05）；HPA-2基因頻率與廣州、美國黑人的差異有統計學意義（P＜0.05）；HPA-3和HPA-15基因頻率與廣州[7]、黑龍江差異有統計學意義（P＜0.05）。HPA-5基因頻率與南京、廣州、黑龍江差異無統計學意義（P＞0.05），與英國白人、美國黑人的差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 ? 血小板CD36抗原檢測結果 ? 經ELISA檢測和流式細胞術確認，564例標本中CD36抗原陽性552例（97.87%），陰性12例（2.13%），CD36缺失率2.13%，其中Ⅰ型CD36缺失1例（8.33%），Ⅱ型CD36缺失11例（91.67%）。

3 ? 討 ? ? ?論

由于HPA存在遺傳多態性，且HPA基因在不同種族、不同地區人群中的分布存在差異，因此HPA抗原在血小板輸注中引起同種免疫的風險具有一定的地域特征[6]，引發的血小板免疫性疾病的幾率也有差異。分析本地區人群HPA基因多態性特點可為臨床需要時提供基因型配合的血小板，對血小板輸注意義重大。

本研究采用實時熒光PCR法結合Taqman探針技術對564例單采血小板獻血員標本HPA-1～6、10、15、21基因進行定性分析檢測，發現HPA-3、15系統有aa、ab、bb 3種表型且雜合程度最高。HPA-1a、2a、4a、5a、6a和21a為本組高頻抗原等位基因，以aa純合子為主，HPA-1b、2b、4b、5b、6b和21b為低頻抗原等位基因，以雜合子形式為主，其中HPA-10系統呈單特異性僅有HPA-10 aa，未檢測出相應的b對偶基因。蘇州地區單采血小板獻血員HPA-1～6、10、15、21系統基因分布頻率與張若洋等[5]報道的結果差異無統計學意義（P＞0.05）；HPA-1a基因頻率與英國白人、美國黑人的差異有統計學意義（P＜0.05），與南京、廣州、黑龍江的差異無統計學意義（P＞0.05），說明中國人群由HPA-1a引起的血小板輸注無效較少見。蘇州地區HPA-2基因頻率與廣州、美國黑人的差異有統計學意義（P＜0.05）；HPA-3和HPA-15基因頻率與廣州[7]、黑龍江的差異有統計學意義（P＜0.05），說明HPA在中國人群中的分布存在一定的地域性。蘇州地區HPA-5基因頻率與南京、廣州、黑龍江的差異無統計學意義（P＞0.05），與英國白人、美國黑人差異有統計學意義（P＜0.05），與文獻[6-7]報道相似。

本研究結果顯示，蘇州地區HPA-3和15系統不配合率分別為0.3660、0.3743，我國其他地區不配合率都較高[8]，HPA-2、HPA-5不配合率是導致血小板無效輸注的主要抗原系統。本研究結果僅顯示HPA-5系統不配合率存在地區差異，蘇州地區HPA-5不配合率低于廣州地區[8]（5a基因頻率0.9731，5b基因頻率0.0269，不配合率0.0510）和中國南方[8]（5a基因頻率0.997，5b基因頻率0.003，不配合率0.0582），高于中國北方[8]（5a基因頻率0.9932，5b基因頻率0.0068，不配合率0.01351）和吉林地區[9]（5a基因頻率0.998，5b基因頻率0.002，不配合率0.004），也進一步證實HPA系統的地區差異性。因此，各地區建立血小板HPA基因資料庫，重點關注各系統的配合，對臨床血小板輸注效果發揮積極作用。

除了HPA系統，近年來亞洲人群血小板CD36抗原缺失引起的輸注無效及并發癥也引起廣泛的關注。CD36抗原缺失分為2種類型，即Ⅰ型（血小板和單核細胞均不表達CD36）和Ⅱ型（僅血小板不表達CD36）缺失。我國不同地區CD36缺失比例為0.75%～4.1%[10]，其中廣州、廣西、深圳、上海和浙江的CD36抗原缺失頻率平均為3.45%，以廣西、浙江頻率較高。本組標本CD36抗原缺失率為2.13%，與本血站前期調查結果2.48%較為相近[3]，其中Ⅰ型缺失占8.33%，Ⅱ型缺失占91.67%。通過此次篩查，我們將重點關注臨床輸注血小板無效的原因，為由于CD36抗原缺失產生同種免疫抗體導致血小板輸注無效的患者提供陰性血小板，以提高血小板輸注效果。

綜上所述，通過對蘇州地區564例單采血小板獻血員HPA基因分型和CD36抗原表型研究，進一步證實血小板抗原的基因分布具有高度多態性，并存在種族和區域差異。下一步我們將對反復輸注血小板的患者進行血小板抗體篩查，了解該類患者血小板無效輸注的免疫因素，制定相應的輸血策略。

[參考文獻]

[1] 董麗，方敏，王玉玨，等. 蘇州地區無償獻血者血小板抗體檢測及結果分析［J］. 中國輸血雜志，2022，35（8）：795-799.

[2] 趙桐茂. 人類血小板抗原（HPA）研究概況［J］. 中國輸血雜志，2004，17（2）：129-132.

[3] 何紅紅，陳婧，陳曄洲，等. 蘇州地區獻血者血小板CD36抗原表型篩查及基因突變分析［J］. 中國輸血雜志，2021，

34（6）：585-589.

[4] 趙陽，胡曉玉，王超，等. 安徽合肥地區單采血小板捐獻者血樣的HPA基因分型［J］. 臨床輸血與檢驗，2022，24（1）：74-79.

[5] 張若洋，陳蓉，劉太香，等. 南京地區血小板捐獻者HPA-1-29bw基因分型檢測［J］. 中國輸血雜志，2021，34（4）：349-353.

[6] 周博，田茂生，馬晨，等. 淄博地區血小板捐獻者HLA-A，B和HPA1-17分型資料庫的建立［J］. 臨床輸血與檢驗，2020，22（5）：510-514.

[7] 蘇湘暉，孫昂，譚濤，等. 岳陽漢族人群血小板抗原基因多態性研究［J］. 中國實驗診斷學，2021，25（11）：1677-1680.

[8] 葉欣，付涌水，羅廣平，等. 廣州地區無償獻血者HPA-1-6，15基因分型及頻率調查［J］. 中國輸血雜志，2008，21（12）：921-924.

[9] 楊帆，韓瑜，焦立新，等. 吉林地區人群HPA-1～6，15系統基因多態性分析［J］. 中國實驗診斷學，2016，20（5）：750-751.

[10] 吳泳倫，孫愛農，蒲菲，等. 中山地區CD36陰性血小板供者庫建立的探討［J］. 中國輸血雜志，2022，35（5）：558-561.

[收稿日期] 2023-01-03

（本文編輯 ? 繆宏建）