大腸桿菌ydiB基因敲除和過表達對氨基糖苷類抗生素的耐受性分析

蔡雅雯，梅振芳，王玉嬋，王 妍

(細胞逆境響應與代謝調控福建省高校重點實驗室/福建師范大學生命科學學院,福建 福州 350108)

隨著抗生素的廣泛開發和應用，細菌的耐藥問題日益嚴重[1-2]。尤其在臨床應用上，常用的氨基糖苷類、喹諾酮類和β-內酰胺類藥物的耐藥性逐年升高[3-5]。為解決抗生素的耐藥性問題，微生物學家們不依不饒地尋找新型抗菌藥物，然而抗生素周期長、開發不易[1-2]等因素使得其始終追不上細菌的更新速度。因此，僅僅依靠開發新藥不能解決細菌耐藥問題，尋找新的藥物靶標也是盡快解決細菌耐藥的方法。近幾年來，細菌的一些獨特能量代謝途徑中的關鍵酶往往成了理想的藥物靶標。例如Singh等[6]發現甲基赤蘚糖醇磷酸途徑中IspH酶的抑制劑化合物和Surivet等[7]發現UDP-3-O-(R-羥基十四酰)-N-乙酰氨基葡糖脫乙酰酶(LpxC)均對多重耐藥菌有殺傷作用，因此這兩種關鍵酶成為開發新型抗菌藥物的目標物。盡管抗菌藥物新靶標陸續被揭露，但大多數細菌的抗生素藥理靶點仍有待開發。

大腸桿菌ydiB基因編碼的是莽草酸途徑的關鍵酶。近些年莽草酸途徑被報道稱是細菌生長所必須的代謝途徑，并且該途徑成為了篩選新型抗結核分枝桿菌藥物的潛在作用靶點[8-9]。也有報道稱莽草酸可以抑制變形鏈球菌的毒力因子[10]，可以破壞金黃色葡萄球菌細胞膜的流動性，因此其具有抗菌活性[11]。由此觀之，莽草酸途徑與細菌耐藥息息相關，然而莽草酸途徑的關鍵基因ydiB與細菌耐藥之間的關聯則暫無報道。針對ydiB基因，目前研究表明其參與了莽草酸的合成，可通過限制莽草酸途徑中間物的質量來提高代謝物流通的效率[12-16]；枯草芽孢桿菌ydiB基因的缺失會降低其生長速率[17]；大腸桿菌PB12中ydiB基因的缺失或過表達會對莽草酸途徑中間產物的產量產生影響[18-19]；甚至還有對YdiB蛋白的晶體結構進行剖析，發現賴氨酸和天冬氨酸在其底物結合中起著關鍵作用等[20-21]。綜上所述，ydiB基因與細菌耐藥有著怎樣的關聯，或者說ydiB基因在莽草酸途徑與細菌耐藥的緊密關系之間是否也扮演著至關重要的角色都有待深究。

因此，本研究采用模式微生物大腸桿菌BW25113(WT)和ydiB基因敲除菌株(△ydiB)開展試驗，通過測試大腸桿菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)對三大類抗生素氨基糖苷類抗生素[22]、喹諾酮類抗生素[23]和β-內酰胺類抗生素[24]的耐受性表現，進一步構建過表達菌株BW25113-pCA24N(ydiB)以及過表達菌株BW25113-pCA24N(ydiB)考察對慶大霉素的耐受性表現，分析ydiB基因與細菌耐藥之間存在潛在聯系，這不僅為解決大腸桿菌對抗生素的耐藥問題提供新的靶點，同時也針對氨基糖苷類抗生素的耐藥機理提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗菌株：大腸桿菌野生型BW25113(WT)和實驗室已有的大腸桿菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)(該敲除的基因被Kana序列所代替，因此敲除株含有kana抗性)。菌種均由細胞逆境響應與代謝調控福建省高校重點實驗室保藏。

1.2 試驗藥品

培養基：LB液體培養基、LB固體培養基、M9+G培養基。上述培養基均經過高壓滅菌鍋121℃，20 min高壓蒸汽滅菌。

抗生素儲液：慶大霉素(Genta)25 mg·mL-1、妥布霉素(Tob)25 mg·mL-1、鏈霉素(Strep)100 mg·mL-1、阿米卡星(Amk)50 mg·mL-1、新霉素(Neo)50 mg·mL-1、環丙沙星(Cip)5 mg·mL-1、氧氟沙星(Ofl)5 mg·mL-1、氨芐西林(Amp)200 mg·mL-1、羧芐西林(Car)200 mg·mL-1、卡那霉素(Kana)50 mg·mL-1、氯霉素(Chl)35 mg·mL-1。上述抗生素配制成溶液，均經過0.22 μm微孔濾膜過濾確保無菌后，儲存至-20℃冰箱備用。

試劑：20% PEG3350、0.01 mol·L-1PBS溶液。上述2個試劑均需高壓滅菌。10%二甲基亞砜(DMSO)、0.15 g·mL-1葡萄糖(Glucose)、1×TAE緩沖液、6×Loading Buffer、1.5 mol·L-1Tris-HCl、0.5 mol·L-1Tris-HCl、10%SDS-PAGE分離膠、5%SDS-PAGE濃縮膠、1×SDS、1×轉膜緩沖液、1×TBST、封閉液、抗體為 ProteinFind Anti-His MouseMonocionalAntibody和Alkaline Phosp hataseconjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H十L)。

1.3 試驗方法

1.3.1菌種活化及稀釋點板方法 (1)菌種活化。取-80℃保存的大腸桿菌野生型BW25113(WT)和ydiB基因敲除菌株(△ydiB)，分別于LB液體培養基和LB液體培養基(含卡那霉素抗性)中以1∶100的比例過夜活化后，以相同比例分別轉接于M9+G培養基和M9+G培養基(含卡那霉素抗性)中培養24 h，即為平臺期細菌菌液。(2)稀釋點板。分別取處理后的菌液100 μL，利用PBS緩沖液10倍稀釋，稀釋梯度為100、101、102、103、104、105，每個梯度取4 μL點于LB固體培養基上，倒放至37℃恒溫培養箱過夜培養，掃描儀掃描獲取板圖，統計細菌的存活數。

1.3.2大腸桿菌ydiB基因敲除菌株的鑒定及測序驗證 根據目的基因上下游200 bp的序列設計兩端引物，以此驗證目的基因是否正確敲除。大腸桿菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)的驗證引物上游序列為ATGATGTGCGGTTTGGCGA，下游序列為GCCATCAGCGAGACGATGATT。

將大腸桿菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)劃線于LB固體培養基(含卡那霉素抗性)，37℃恒溫培養箱過夜培養。取4個PCR管，加入一定量的ddH2O、Mix和上下游引物并混勻，最后于超凈工作臺內分別挑取3個大腸桿菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)的單克隆至3個不同的PCR管中，剩余的最后1個PCR管內加入用LB液體培養基過夜活化好的野生型BW25113(WT)作為對照進行PCR反應。PCR程序：首先將樣品94℃預變性5 min，其次94℃變性30 s、55℃退火30 s后72℃延伸90 s，這3個步驟重復30個循環，緊接著72℃終延伸10 min，最后將樣品保存至4℃或直接利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR片段大小，Marker選用2K plus DNA ladder(全式金)，凝膠成像儀觀察結果。PCR未純化產物送尚亞公司測序。

1.3.3三大類抗生素對大腸桿菌ydiB基因敲除菌株的殺菌測試 (1)氨基糖苷類抗生素對大腸桿菌ydiB基因敲除菌株的殺菌測試。取平臺期大腸桿菌野生型BW25113(WT)和ydiB基因敲除菌株(△ydiB)分別轉接至含有5 μg·mL-1慶大霉素、5 μg·mL-1妥布霉素、50 μg·mL-1鏈霉素、25 μg·mL-1阿米卡星和25 μg·mL-1新霉素的M9+G培養基中處理3 h。(2)喹諾酮類和β-內酰胺類抗生素對大腸桿菌ydiB基因敲除菌株的殺菌測試。取平臺期大腸桿菌野生型BW25113(WT)和ydiB基因敲除菌株(△ydiB)分別轉接至含有5 μg·mL-1環丙沙星、5 μg·mL-1氧氟沙星、100 μg·mL-1氨芐西林和100 μg·mL-1羧芐西林的M9+G培養基中處理3 h。

1.3.4過表達菌株BW25113-pCA24N(ydiB)的構建及表達 利用實驗室已有的大腸桿菌野生型BW25113(WT)感受態和空質粒pCA24N及pCA24N(ydiB)質粒，轉化出BW25113-pCA24N和BW25113-pCA24N(ydiB)菌株，并利用免疫印跡法(Western Blot)檢測ydiB基因過表達的情況，具體步驟如下：

轉化：取-80℃保存的2管野生型BW25113感受態細胞于冰上化凍，分別加入2 μL空質粒pCA24N和2μL pCA24N(ydiB)質粒后置于冰上30 min，42℃金屬浴熱擊90 s，立即將其輕輕地置于冰上2 min；隨后向EP管內加入900 μL LB液體培養基，于37℃、220 r·min-1搖床培養1 h后取出；離心去除900 μL上清，剩余100 μL菌液重懸，涂布于LB固體培養基(含氯霉素抗性)上，吹干后倒置于37℃恒溫培養箱過夜培養。隔天挑取單克隆至1 mL LB液體培養基(含氯霉素抗性)中，過夜培養，與40%甘油1∶1混合至-80℃冰箱保存。

Western Blot檢測：取-80℃保存的BW25113-pCA24N和BW25113-pCA24N(ydiB)菌株，于LB液體培養基(含氯霉素抗性)中以1∶100的比例過夜活化后，以相同比例轉接于M9+G培養基(含氯霉素抗性)中培養24 h后，將此刻的菌株分別轉接于不含有1 mmol IPTG的M9+G培養基和含有1 mmol IPTG的M9+G培養基中培養1 h。各取出500 μL至無菌1.5 mL EP管中，13000 r·min-1離心2 min，棄上清，以1∶1的比例分別加入10%SDS和6× Loading Buffer，混勻后終體積為50 μL，于100℃金屬浴加熱15 min，即完成蛋白制樣。配置10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，加入10 μL制好的蛋白樣品和5 μLProtein Marker(10～180 kDa)在1×SDS緩沖液中跑膠，電泳結束后，裁剪適宜的Millipore PVDF 0.45 μm膜，用甲醇醒至0.5～1 min后，將蛋白膠取下，切去無樣品區域，放置在提前浸泡好的轉膜裝置黑面，Millipore PVDF 0.45 μm膜隨即放在蛋白膠上，閉合并安裝好轉膜裝置后，倒入轉膜液，置于冰水混合液中開始轉膜。轉膜結束后封閉1 h。封閉結束后倒入一抗于水平搖床孵育0.5 h后，放置4℃冰箱過夜孵育。隔天回收一抗，用1×TBST洗脫3次，1次10 min，隨即倒入二抗，在水平搖床上孵育90 min，回收二抗，同樣用1×TBST洗脫3次，1次10 min。最后配置BCIP/NBT顯色試劑，倒入裝有Millipore PVDF 0.45 μm膜中于水平搖床緩慢均勻搖晃 5～10 min，觀察到蛋白條帶后，立即終止顯色。

1.3.5慶大霉素對BW25113-pCA24N(ydiB)菌株的殺菌測試 發現大腸桿菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)只對氨基糖苷類抗生素耐受，想驗證是否ydiB基因過表達之后，能恢復對氨基糖苷類抗生素的敏感性。倘若實驗結果與設想一致，則ydiB基因將有望成為解決細菌耐藥問題的靶點。

取-80℃保存的大腸桿菌野生型BW25113(WT)、ydiB基因敲除菌株(△ydiB)、BW25113-pCA24N和BW25113-pCA24N(ydiB)菌株，分別以1∶100的比例于LB液體培養基、LB液體培養基(含卡那霉素抗性)、LB液體培養基(含氯霉素抗性)和LB液體培養基(含氯霉素抗性)中過夜活化后，分別轉接于M9+G培養基、M9+G培養基(含卡那霉素抗性)、M9+G培養基(含氯霉素抗性)和M9+G培養基(含氯霉素抗性)中培養24 h，最后分別轉接至M9+G培養基中，在BW25113-pCA24N和BW25113-pCA24N(ydiB)菌株中加入1 mmoL IPTG誘導劑，誘導1 h后，在4個搖菌管中均加入5 μg·mL-1慶大霉素處理3 h。

1.4 數據處理與分析

數據統計采用ANOVA方差分析，試驗數據均為3次獨立試驗取得。

2 結果與分析

2.1 大腸桿菌ydiB基因敲除驗證

大腸桿菌ydiB基因的序列被Kana序列替換，從而構成敲除菌株。以大腸桿菌野生型BW25113菌株為對照的瓊脂糖凝膠電泳條帶應為1044 bp，而Kana基因片段長于ydiB基因片段，則大腸桿菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)的瓊脂糖凝膠電泳條帶會高于野生型BW25113(WT)菌株的條帶(如圖1 A所示)。由圖1 B可知，利用Vector NTI軟件分析測序結果與NCBI上的Kana序列比對成功，表明ydiB基因敲除成功。

圖1 大腸桿菌ydiB基因敲除成功的PCR及測序結果

2.2 大腸桿菌ydiB基因敲除菌株的耐受性分析

2.2.1大腸桿菌ydiB基因敲除菌株對氨基糖苷類抗生素的耐受性分析 由圖2可知，在氨基糖苷類抗生素的脅迫下，相比野生型BW25113(WT)，ydiB基因敲除菌株對5 μg·mL-1慶大霉素(圖2 A)、5 μg·mL-1妥布霉素(圖2 B)、50 μg·mL-1鏈霉素(圖2 C)、25 μg·mL-1阿米卡星(圖2 D)、25 μg·mL-1新霉素(圖2 E)有較高的耐受現象。綜上所述，大腸桿菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)對氨基糖苷類抗生素耐受，且耐受程度高。

注：****表示在氨基糖苷類抗生素的脅迫下，大腸桿菌野生型BW25113菌株和大腸桿菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)的存活數具有極顯著差異，P<0.0001。

2.2.2大腸桿菌ydiB基因敲除菌株對喹諾酮類和β-內酰胺類抗生素的耐受性分析 由圖3可知，在喹諾酮類和β-內酰胺類抗生素的脅迫下，5 μg·mL-1環丙沙星(圖3 A)、5 μg·mL-1氧氟沙星(圖3 B)、100 μg·mL-1氨芐西林(圖3 C)、100 μg·mL-1羧芐西林(圖3 D)對大腸桿菌野生型BW25113和ydiB基因敲除菌株(△ydiB)有相同的殺傷力，兩者之間無差異。因此，大腸桿菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)不耐受于喹諾酮類和β-內酰胺類抗生素。

注：NS表示在喹諾酮類和β-內酰胺類抗生素的脅迫下，大腸桿菌野生型BW25113菌株和大腸桿菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)的存活數沒有顯著差異，P>0.05。

2.3 BW25113-pCA24N(ydiB)過表達菌株的構建

由圖4可知，經過ITPG誘導后才能使ydiB基因表達。與過表達空載質粒菌株對比，BW25113-pCA24N(ydiB)菌株目標蛋白成功表達。

圖4 BW25113-pCA24N(ydiB)菌株目標蛋白成功表達

2.4 BW25113-pCA24N(ydiB)菌株對慶大霉素的敏感性分析

以氨基糖苷類抗生素中的慶大霉素為代表，探究BW25113-pCA24N(ydiB)菌株對慶大霉素的敏感性。由圖5可知，大腸桿菌野生型BW25113(WT)、ydiB基因敲除菌株(△ydiB)、BW25113-pCA24N和BW25113-pCA24N(ydiB)4個菌株在1 mmol IPTG誘導前后的菌量一致，說明1 mmol IPTG不會對菌株產生毒害作用。當5 μg·mL-1慶大霉素處理3 h后，大腸桿菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)的表型為耐受，而BW25113-pCA24N(ydiB)菌株的表型恢復敏感，與野生型BW25113(WT)的存活數基本一致。綜上所述，ydiB基因的缺失能夠干擾慶大霉素的殺菌效果。

注：****表示在慶大霉素的脅迫下，大腸桿菌野生型BW25113菌株和大腸桿菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)的存活數具有極顯著差異，P<0.0001。NS表示在慶大霉素的脅迫下，BW25113-pCA24N和BW25113-pCA24N(ydiB)菌株的存活數沒有顯著差異，P>0.05。

3 結論與討論

隨著細菌耐藥問題逐漸上升為全球性問題，新藥的開發周期長難度大，研發速度遠遠落后于細菌耐藥出現的速度，因此挖掘新靶點成為解決細菌耐藥問題的有效途徑。本研究發現大腸桿菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)能躲避氨基糖苷類抗生素的殺滅作用，而BW25113-pCA24N(ydiB)菌株能恢復對慶大霉素的敏感性。該結果證實了ydiB基因能干擾氨基糖苷類抗生素發揮殺菌作用，也證實了ydiB基因與細菌耐藥之間的潛在聯系。

針對ydiB基因如何干擾氨基糖苷類抗生素的殺菌作用還有待后續深層研究。后續的研究可以從氨基糖苷類抗生素已知的殺菌機制入手，思考以下幾個問題：是否ydiB基因的缺失導致莽草酸脫氫酶失活，阻斷莽草酸代謝途徑，迫使大腸桿菌降低細菌跨膜質子動力勢，減少對抗生素的攝取？或是迫使大腸桿菌減少蛋白質的聚集？又或是迫使大腸桿菌降低ATP、消耗活性氧自由基等[24-26]？未來，若能揭開大腸桿菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)躲避氨基糖苷類抗生素殺滅作用的機制，則有助于開發對抗細菌耐藥的工具。