頂空氣質(zhì)聯(lián)用法鑒別不同發(fā)育期蠶豆花揮發(fā)性成分

徐曉俞，李程勛，陳常飛，潘 鍵，侯明香，李愛萍*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所, 福建 福州 350013; 2.連江縣丹陽鎮(zhèn)飛常家庭農(nóng)場, 福建 福州 350503; 3.福鼎市花千樹農(nóng)業(yè)科技有限公司,福建 福鼎 355200; 4.永泰縣川山生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司, 福建 福州 350700)

蠶豆ViciafabaL.是人類最早栽培的豆類作物之一，在我國已有2000多年的栽培歷史。蠶豆是世界第七大食用豆類作物，近年來，中國蠶豆種植面積達130多萬hm2，占世界總面積的45.7%，為世界第1蠶豆生產(chǎn)大國[1]。蠶豆在全國大多數(shù)省份都可種植，分為秋播區(qū)和春播區(qū)。在福建，蠶豆以秋播為主，是重要的冬種經(jīng)濟作物，常年種植面積達到4萬hm2左右。蠶豆花為蠶豆的干燥花，是民間傳統(tǒng)中藥材，性平、味澀、無毒[2]。中醫(yī)認為，蠶豆花具有涼血、止血的功效，可用于治療咳血、鼻衄、血痢、帶下、高血壓病等[3-4]。蠶豆在開花過程中常采取人工摘除每花序中的無效小花，以減少花朵的營養(yǎng)競爭，提高結(jié)莢率，可采摘鮮花約2250 kg·hm-2，摘除的蠶豆花未被很好的利用，造成資源的浪費[2]。關(guān)于蠶豆花揮發(fā)性成分的研究報道較少，僅見蠶豆花精油化學(xué)成分的報道。傅桂香等[5]利用水蒸氣蒸餾提取蠶豆花精油，采用毛細管氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析了蠶豆花精油的化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)蠶豆花主要成分為醇類和酸類。目前開展較多的研究主要有蠶豆花非揮發(fā)性化學(xué)成分的提取、分離、鑒定、檢測。郭向群等[3]首次從蠶豆花中分離、鑒定出槲皮素和山奈酚，并建立HPLC檢測方法。左旋多巴是治療帕金森病的藥物，在蠶豆花、莖、葉、莢殼、種皮、子葉等部位均有分布，以蠶豆花中的含量最高[2]，不同花色[2]、不同品種[6]間含量具有顯著差異。蠶豆花氣微香，在發(fā)育的過程中逐漸釋放出揮發(fā)性成分，而關(guān)于不同發(fā)育期蠶豆花揮發(fā)性成分的研究還未見報道，這對于了解蠶豆花揮發(fā)性成分的變化規(guī)律，明確揮發(fā)性成分的生物功能都有重要的指導(dǎo)意義。本研究以福蠶1號蠶豆花為研究材料，采用頂空-氣質(zhì)聯(lián)用法鑒別不同發(fā)育期蠶豆花揮發(fā)性成分及其相對含量，對蠶豆花揮發(fā)性成分進行分析和鑒定，比較不同發(fā)育期揮發(fā)性成分的差異，以期為蠶豆花揮發(fā)性成分的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料福蠶1號蠶豆花于2022年3月5日采自福建省福州市連江縣丹陽鎮(zhèn)蠶豆種植基地，并于當(dāng)日運往福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研綜合實驗中心進行檢測。

1.2 試驗儀器

主要有Thermo Scientific TSQ 9000三重四級桿氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國賽默飛世爾科技公司)和Thermo Scientific TriPlus 300頂空自動進樣器(美國賽默飛世爾科技公司)。

1.3 試驗設(shè)計

分別采集花蕾期、初開期、盛開期、凋謝期4個發(fā)育期的蠶豆花，用于檢測揮發(fā)性成分，各設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。將采集的蠶豆花放入20 mL頂空瓶中，待測。

1.4 試驗方法

頂空條件：爐溫90℃，腔溫110℃，傳輸線溫度135℃，樣品瓶平衡時間5 min。

色譜條件：TG-5SilMS色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；進樣量1 mL，載氣為純氦氣(99.99%)，恒流模式，流量1.2 mL·min-1，分流流量14.0 mL·min-1，分流比12∶1；程序升溫：柱溫起始溫度50℃保持5 min，以5℃·min-1升溫至160℃，再以10℃· min-1升溫至250℃保持5 min。總程序時間42 min。

質(zhì)譜條件：進樣口溫度250℃；電離方式EI，離子源溫度300℃；質(zhì)譜全掃描方式，掃描質(zhì)量范圍30～550 amu。

1.5 數(shù)據(jù)分析

測定的氣相色譜峰根據(jù)色譜保留時間，對比NIST 2019標(biāo)準(zhǔn)譜庫中的質(zhì)譜信息對每個成分進行初步鑒定，并結(jié)合參考文獻定性，以譜庫匹配度大于80%作為定性標(biāo)準(zhǔn)。每個成分的物質(zhì)含量以相對含量表示，運用峰面積歸一化法，求得各成分的相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)育期蠶豆花的揮發(fā)性成分分析

不同發(fā)育期蠶豆花揮發(fā)性成分總離子流圖見圖1。

注：A為花蕾期；B為初開期；C為盛開期；D為凋謝期

2.1.1蠶豆花總揮發(fā)性成分分析 由表1可知，從蠶豆花中共分離鑒定出35種揮發(fā)性成分，包括醇類、酯類、醛類、酮類、萜烯類、烷烴類、芳香族類、生物堿類成分。從花蕾期、初開期、盛開期、凋謝期蠶豆花中分別鑒定出12、14、18、20種揮發(fā)性成分，相對總含量分別為80.90%、83.46%、81.53%、84.56%。蠶豆花花蕾期相對含量較高的揮發(fā)性成分有苯乙醇、正己醛、溴化香葉酯、蘑菇醇，分別為20.86%、17.98%、12.96%、9.89%；初開期相對含量較高的揮發(fā)性成分有正己醛、溴化香葉酯、蘑菇醇，分別為26.22%、21.96%、7.36%；盛開期相對含量較高的揮發(fā)性成分有β-蒎烯、正己醛，分別為22.36%、16.18%；凋謝期相對含量較高的揮發(fā)性成分有β-蒎烯、正己醛、苯甲醛、苯乙醇，分別為16.80%、13.55%、13.31%、8.31%。

表1 不同發(fā)育期蠶豆花揮發(fā)性成分及其相對含量

2.1.2不同發(fā)育期蠶豆花的揮發(fā)性成分差異 不同發(fā)育期蠶豆花揮發(fā)性成分總相對含量相近，均達到80%～85%，因此可用相對含量來比較不同發(fā)育期蠶豆花各揮發(fā)性成分的含量差異。(1)蠶豆花醇類物質(zhì)中相對含量較高的成分有蘑菇醇和苯乙醇。隨著蠶豆花發(fā)育時間的延長，蘑菇醇相對含量逐漸降低，以花蕾期相對含量最高，達9.89%，在凋謝期降至2.68%；苯乙醇相對含量呈先下降后上升趨勢，以花蕾期相對含量最高，達20.86%，在盛開期降至最低，為2.63%，在凋謝期上升至8.31%。(2)蠶豆花中僅檢測到兩種酯類成分，分別是溴化香葉酯和丁酸芳樟酯。蠶豆花從花蕾期進入初開期，溴化香葉酯的相對含量由12.96%上升為21.96%，但在盛開期和凋謝期未檢測到。丁酸芳樟酯在花蕾期未檢測到，隨著蠶豆花發(fā)育時間的延長，丁酸芳樟酯的相對含量由初開期1.02%逐漸上升為凋謝期4.35%。(3)蠶豆花醛類物質(zhì)中相對含量較高的揮發(fā)性成分有正己醛和苯甲醛。隨著蠶豆花發(fā)育時間的延長，正己醛相對含量呈先上升后下降趨勢，由花蕾期17.98%上升為初開期26.22%，后逐漸下降至凋謝期13.55%。花蕾期和初開期的蠶豆花未檢測到苯甲醛，盛開期相對含量為5.74%，在凋謝期上升至13.31%。(4)蠶豆花中僅檢測到兩種酮類成分。隨著蠶豆花發(fā)育時間的延長，3-辛酮相對含量呈逐漸降低趨勢，以花蕾期相對含量最高，達3.67%，在凋謝期已檢測不到。7-亞甲基雙環(huán)[3.2.0]庚-3-烯-2-酮僅在凋謝期檢測到，相對含量為1.84%。(5)蠶豆花中共檢測到3種萜烯類成分。隨著蠶豆花發(fā)育時間的延長，β-松油烯相對含量呈先上升后下降趨勢，以初開期相對含量最高，達1.67%。花蕾期和初開期的蠶豆花未檢測到β-蒎烯，盛開期相對含量為22.36%，進入凋謝期降至16.80%。花蕾期和初開期的蠶豆花未檢測到α-香檸檬烯，盛開期相對含量為2.86%，進入凋謝期上升至3.60%。(6)蠶豆花烷烴類成分中相對含量較高的成分為2-氨基-5-甲基己烷，隨著蠶豆花發(fā)育時間的延長，2-氨基-5-甲基己烷相對含量呈先上升后下降趨勢，在盛開期相對含量最高，達5.78%。(7)蠶豆花中僅檢測到兩種芳香族類成分。氫化安息香僅在花蕾期檢測到，相對含量為2.62%。苯基-1，2-乙二醇環(huán)狀亞硫酸鹽相對含量隨著蠶豆花發(fā)育時間的延長而逐漸上升，但在凋謝期未檢測到。(8)蠶豆花中檢測到4種生物堿類成分，相對含量均較低。

2.2 不同發(fā)育期蠶豆花揮發(fā)性成分種類

由表2可知，發(fā)育期蠶豆花揮發(fā)性成分均以醇類的數(shù)量最多，隨著蠶豆花發(fā)育，醇類成分的數(shù)量呈逐漸上升趨勢。從種類的相對含量上分析，花蕾期和初開期均以醇類、酯類、醛類成分為主，盛開期和凋謝期均以醇類、醛類、萜烯類成分為主。醇類相對含量呈先下降后上升趨勢，以花蕾期相對含量最高，達34.06%，酯類相對含量呈先上升后下降趨勢，以初開期相對含量最高，達22.98%，醛類相對含量總體上呈上升趨勢，以凋謝期相對含量最高，達30.96%，萜烯類成分在花蕾期未檢測到，相對含量呈先上升后下降趨勢，以盛開期相對含量最高，達26.86%。總的來說，醇類、酯類、醛類、萜烯類成分是蠶豆花的主要揮發(fā)性物質(zhì)，對蠶豆花氣味具有重要貢獻。隨著蠶豆花發(fā)育時間的延長，揮發(fā)性成分的數(shù)量逐漸增加，種類也更加多樣。

表2 不同發(fā)育期蠶豆花揮發(fā)性成分種類及其相對含量

3 討論

植物次生代謝產(chǎn)物是植物對環(huán)境的一種適應(yīng)，是在長期進化過程中植物與生物和非生物因素相互作用的結(jié)果。蠶豆是常異花授粉作物，平均異交率在30%左右，主要靠蜂類蟲媒傳粉，而蟲媒的采蜜行為是異花授粉的主要途徑[7]。因此，蠶豆在開花過程釋放的揮發(fā)性成分可能與吸引昆蟲前來采蜜有關(guān)。

蠶豆花中的主要揮發(fā)性成分蘑菇醇具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香氣[8]，研究表明蘑菇醇對傳粉昆蟲中華蜜蜂有吸引作用[9]。隨著蠶豆花發(fā)育，蘑菇醇的相對含量從花蕾期的9.89%下降到凋謝期的2.68%，而蠶豆花授粉期主要在花蕾期和初開期進行，需要傳粉昆蟲進行傳粉，到了盛開期和凋謝期蠶豆花已完成授粉并結(jié)莢，因此隨著蠶豆花發(fā)育，通過花香對蟲媒的吸引需求減弱，蘑菇醇相對含量也隨之下降。蠶豆花釋放的揮發(fā)性成分可能也與防御外來病原微生物、害蟲有關(guān)。苯乙醇具有清甜的玫瑰樣花香[10]，研究表明苯乙醇是用于眼用溶液的一種防腐劑，對各種細菌和真菌具有抑制作用[11]，在蠶豆花發(fā)育過程中相對含量呈先下降后上升趨勢，可能與開花前期保護花蕾安全授粉與開花后期保護幼莢防御病菌有關(guān)。丁酸芳樟酯具有類似香檸檬的香氣，稀釋后具有類似蜂蜜、柑橘的香氣[12]，是紅脈穗螟等害蟲驅(qū)避劑的主要成分之一[13]。在蠶豆花花蕾期未檢測到丁酸芳樟酯，隨著蠶豆花進一步發(fā)育，丁酸芳樟酯的相對含量呈逐漸上升趨勢，至凋謝期達到4.35%，對蠶豆幼莢起到防御害蟲的作用。正己醛具有青草氣及粗青氣[14]，是蜜蜂用來辨識與自己親緣關(guān)系較近工蜂的重要化學(xué)氣味[15]，在蠶豆花花蕾期、初開期授粉階段表現(xiàn)出較高的相對含量，以吸引蟲媒傳粉。苯甲醛具有苦杏仁香、甜香氣、新鮮和輕飄的果香[16]，對真菌生長有明顯的抑制作用，對果蔬具有保鮮效果[17]。苯甲醛是植物防御害蟲的重要信息物質(zhì)[18]，還能引誘天敵寄生蜂對寄主昆蟲進行定位，減少植食性昆蟲為害，從而達到間接防御的目的[19]，僅在蠶豆花盛開期、凋謝期檢測到，且相對含量呈上升趨勢，起到防御害蟲和吸引害蟲天敵的作用。3-辛酮具有果實香味，常用于薰衣草香型香精的勾兌。據(jù)報道，3-辛酮是紫花苜蓿吸引訪花昆蟲進行花粉傳播的主要揮發(fā)性成分[20]。本研究結(jié)果表明3-辛酮在蠶豆花花蕾期相對含量最高，之后呈逐漸下降趨勢，在凋謝期檢測不到，表明其在蠶豆花授粉階段主要起到吸引傳粉昆蟲的作用。芳香性萜烯類物質(zhì)不僅能保護植物免受細菌、真菌和寄生蟲等的侵害，對人類健康亦有廣泛的積極作用[21]。β-松油烯是一種單萜類香氣成分，具有花香或果實香，對支氣管有溫和的刺激作用，吸入作為祛痰劑[22]。β-蒎烯是一種單萜類香氣成分，具有干木香、樹脂香[23]。研究顯示，β-蒎烯具有抑菌活性，對柑橘青霉病菌具有較好的抑制效果[24]，對沙門氏菌也有抑制活性[25]，具有作為天然食品防腐劑的潛力。同時，β-蒎烯是一種重要的植物防御物質(zhì)[26]。β-蒎烯在蠶豆花花蕾期和初開期未檢測，而在盛開期和凋謝期相對含量較高。α-香檸檬烯是一種倍半萜類香氣成分，具有微弱木香氣味[27]，與植物間接防御有關(guān)[28]，僅在盛開期和凋謝期檢測到，且相對含量呈上升趨勢。因此可以推測β-蒎烯、α-香檸檬烯等萜烯類物質(zhì)在蠶豆開花后期主要對幼莢起到防御害蟲和微生物侵害的作用。

4 結(jié)論

本研究從蠶豆花中共分離鑒定出35種揮發(fā)性成分，包括醇類、酯類、醛類、酮類、萜烯類、烷烴類、芳香族類、生物堿類成分。隨著蠶豆花發(fā)育時間的延長，揮發(fā)性成分逐漸釋放，揮發(fā)性成分的數(shù)量逐漸增加。醇類成分的相對含量呈先下降后上升趨勢，酯類成分的相對含量呈先上升后下降趨勢，醛類成分的相對含量總體上呈上升趨勢，萜烯類成分的相對含量呈先上升后下降趨勢。研究結(jié)果表明，醇類、酯類、醛類、萜烯類是蠶豆花的主要揮發(fā)性物質(zhì)，對蠶豆花主體氣味具有重要貢獻，這些揮發(fā)性成分的產(chǎn)生是蠶豆長期進化過程適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果，在蠶豆花的發(fā)育過程中，開花授粉階段的揮發(fā)性成分主要起到吸引蟲媒的作用，而在結(jié)莢后的盛花期和凋謝期主要起到抵御病原菌和害蟲侵害的作用。凋謝期蠶豆花揮發(fā)性成分豐富，可提取用于開發(fā)昆蟲引誘劑、驅(qū)避劑或植物源天然保鮮劑。