不同益生菌發酵猴頭菇對粗多糖提取工藝及其抗氧化能力的影響

陳壽輝，吳 俐，孫鈞政，肖志勇，李怡彬*

[1.福建省農業科學院農產品加工研究所, 福建 福州 350003; 2.農業農村部亞熱帶特色果蔬菌加工重點實驗室, 福建 福州 350003; 3.國家食用菌加工技術研發分中心,福建 福州 350003; 4.福建省農產品(食品)加工重點實驗室, 福建 福州 350003;5.福建拓天生物科技有限公司, 福建 福州 350003]

猴頭菇Hericiumerinaceus(Bull.)Pers.，為齒菌科，屬真菌，在自然界中分布廣泛，既是食用珍品也是重要的藥用菌[1]。猴頭菇多糖具有增強免疫力[2]、抗氧化[3]、抗衰老[4]、降血糖[5]等多方面的功能，在醫藥保健行業[6]、食品加工行業等有著廣泛應用，因此，如何高效制備猴頭菇多糖成了其商業化生產的關鍵步驟。前人研究表明，超聲提取法、微波提取法與益生菌發酵法能顯著提高多糖提取率。張浩然等[7]利用超聲法提取猴頭菇多糖，能顯著提高多糖提取率；和法濤等[8]利用微波超聲波組合提取猴頭菇多糖，在最優工藝條件下，多糖提取率為6.44%，顯著高于熱水浸提法；趙玉潔等[9]發現經乳酸桿菌發酵后，顯著提高半枝蓮、甘草的多糖提取率；劉濤等[10]利用酵母菌發酵貓抓草，發現貓爪草多糖產量顯著提高；Pei等[11]利用益生菌發酵藍金銀花，使其多糖分子量降低，并表現出更強的ABTS自由基清除能力。猴頭菇具有堅韌的細胞壁結構，制約著細胞內儲存的多糖、蛋白質、脂類等營養物質的有效萃取和產品加工。因此，建立省時、節能、高效的猴頭菇細胞破壁技術是多糖等高值天然化合物萃取及其商業化生產的關鍵環節之一。同時，猴頭菇含有蛋白質、脂肪、多糖及單糖等成分，去除猴頭菇中的脂肪和單糖等物質是實現高效提取多糖的關鍵技術。本研究探討不同益生菌發酵處理猴頭菇對其粗多糖提取率的影響，采用正交試驗法優化益生菌發酵工藝條件，獲得最佳發酵工藝，并考察益生菌發酵對猴頭菇粗多糖總抗氧化能力與紅外光譜結構的影響，以期為高效制備猴頭菇多糖提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

猴頭菇為市售優質猴頭菇，購自福建省古田縣。

1.2 主要試劑和主要儀器

主要試劑：葡萄糖、苯酚、無水乙醇、溴化鉀、濃硫酸等，均購自國藥集團化學試劑有限公司，嗜酸乳桿菌(1000 cfu·mg-1)、長雙歧桿菌(1000 cfu·mg-1)購自西安米先爾生物科技有限公司；酵母菌(高糖型)購自安琪酵母股份有限公司；總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒購自北京萊寶科技有限公司。

主要儀器：熱泵烘干機組ZWH-KFX-BT12Ⅱ(福建雪豐制冷設備有限公司)；高效粉碎機GFSJ-8(江陰市瑰寶制藥機械廠)；微波光波超聲波萃取儀SCIENTZ-11DW(寧波新芝生物科技有限公司)；高速離心機GL10MD(湘儀離心機公司)；糖度計PAL-1(秋佐科技ATago愛拓有限公司)；電子天平ME2002E/02[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；紫外可見光分光光度計TU-1810(北京普析通用儀器有限責任公司)；傅里葉紅外光譜iCAN9(天津市能譜科技有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1猴頭菇水提物與粗多糖提取工藝流程 猴頭菇水提物與粗多糖提取工藝流程見圖1。

圖1 猴頭菇水提物與粗多糖提取工藝流程

1.3.2猴頭菇預處理 將猴頭菇放入50℃熱泵干燥中烘干，用粉碎機粉碎后利用索氏提取法抽出猴頭菇粉末內的油脂，烘干至恒重，備用。

1.3.3不同提取方式對猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響 參考賈冬舒等[12]、樊偉偉等[13]的方法稍做修改，取預處理后的猴頭菇粉末與純凈水按1∶25的料液比混勻，分為無處理、超聲波處理、微波處理與超聲波-微波協同處理4組，設定超聲功率為400 w、時間10 min，微波功率90 w、時間30 s、提取4次，經不同處理后采用熱水浸提法在90℃下浸提30 min，經6000 r·min-1離心10 min，合并上清液，共提取1次，濃縮后部分冷凍干燥得到猴頭菇水提物，部分經醇沉后冷凍干燥得到猴頭菇粗多糖。測定猴頭菇水提物與粗多糖提取率，并計算提取物中粗多糖含量，并挑選出最佳工藝。

1.3.4不同益生菌發酵對猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響 分別稱取3 g預處理后的猴頭菇粉末按1∶25的料液比與純凈水混勻后，分為酵母菌(高糖型)發酵、長雙歧桿菌發酵、嗜酸乳桿菌發酵與未加菌種4組，在對應組加入0.3 g酵母菌(高糖型)、長雙歧桿菌與嗜酸乳桿菌，放入不同溫度搖床中震蕩并調試其pH值，其中，酵母菌(高糖型)發酵環境為pH 4.7、發酵溫度28℃；長雙歧桿菌發酵環境為pH 6.7、發酵溫度39℃；嗜酸乳桿菌發酵環境為pH 5.8、發酵溫度37℃。搖床轉速為60 r·min-1，培養24 h后，取出在100℃下滅菌10 min后超聲波處理，超聲功率400 w、超聲時間10 min，超聲后其余步驟按1.3.3處理，研究不同益生菌對猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響，并挑選出最佳益生菌。

1.3.5單因素試驗 (1)料液比對猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響。稱取3 g猴頭菇樣品粉末設定料液比為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，調節溶液pH為6.7，長雙歧桿菌添加量為0.3 g，在溫度為39℃下，發酵16 h，其余步驟同1.3.4，研究料液比對猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響。(2)發酵時間對猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響。稱取3 g猴頭菇樣品粉末按1∶30的料液比與純凈水混勻，調節溶液pH為6.7，長雙歧桿菌添加量為0.3 g，在溫度為39℃下，分別設定發酵時間為4、8、12、16 h，其余步驟同1.3.4，研究發酵時間對猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響。(3)發酵溫度對猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響。分別稱取3 g猴頭菇樣品粉末按1∶30的料液比與純凈水混勻，調節溶液pH為6.7，長雙歧桿菌添加量為0.3 g，分別設定培養溫度為36℃、39℃、42℃、45℃，發酵16 h，其余步驟同1.3.4，研究發酵溫度對猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響。(4)長雙歧桿菌添加量對猴頭菇水提物和粗多糖提取的影響。稱取3 g猴頭菇樣品粉末按1∶30的料液比與純凈水混勻，調節溶液pH至6.7，分別設定長雙歧桿菌添加量為0.15、0.3、0.45、0.6 g，在溫度為39℃下，發酵16 h，其余步驟同1.3.4，研究長雙歧桿菌添加量對猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響。

1.3.6正交試驗設計 本試驗采用L9(33)正交設計(表1)，根據前期單因素試驗固定料液比為1∶20，確定單因素分別為長雙歧桿菌添加量、發酵時間、發酵溫度，且確定各因素的3個水平，分析各因素水平對猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響。

表1 猴頭菇粗多糖提取正交試驗因素水平

1.3.7猴頭菇粗多糖總抗氧化能力 在前期研究中，發現不同提取方法與益生菌發酵后猴頭菇水提物提取率和水提物中粗多糖含量有著顯著的影響，總抗氧化能力(T-AOC)是體現人體抗氧化能力非常重要的指標，其可以很好地表示人體清除自由基的總能力，測定猴頭菇粗多糖的總抗氧化能力以佐證其具有較高的價值，旨為猴頭菇深加工與功能評價提供參考。

根據索萊寶總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒進行總抗氧化能力的測定，所得到的回歸方程為Y=0.3329x+0.0008，R2=0.9932，線性關系良好。

總抗氧化能力(μmol·g-1)= 34×x÷w

式中，x為Fe2+終濃度值，w為樣品質量。

1.3.8猴頭菇粗多糖傅里葉紅外光譜分析 通過不同益生菌發酵猴頭菇粗多糖的總抗氧化能力的影響可知，不同益生菌發酵后其總抗氧化能力各不相同，為了解是否因菌種發酵導致其官能團出現變化，采用傅里葉紅外光譜對其進行分析。

取一定量不同處理的猴頭菇多糖與溴化鉀混合均勻后，在瑪瑙研缽中磨至成粉末，壓片，采用傅里葉紅外光譜在4000～400 cm-1范圍內共掃描32次，分辨率為4 cm-1，以空氣作為空白背景。

1.4 指標測定

1.4.1猴頭菇水提物提取率測定 將冷凍干燥后的猴頭菇水提物重量為m，計算猴頭菇水提物提取率。

水提物提取率(%)=m÷M×100

式中：m冷凍干燥后的猴頭菇水提物質量，g；M為猴頭菇樣品質量，g。

1.4.2猴頭菇水提物中粗多糖含量與粗多糖提取率的測定 參照SN/T 4260-2015《出口植物源食品中粗多糖的測定 苯酚-硫酸法》測定猴頭菇粗多糖含量。所得到的回歸方程為Y=0.0107X+0.0232，R2=0.9971，線性關系較好。

樣品的測定：取1 mg的猴頭菇水提物與猴頭菇粗多糖，用蒸餾水分別定容至10 mL，配置為100 ug·mL-1的猴頭菇水提物溶液與粗多糖溶液，如上方法測定吸光度值，參照葡萄糖標準曲線計算樣品多糖含量，進而計算猴頭菇粗多糖提取率：

水提物中粗多糖含量(%)=m1÷m2×V1×0.9×10-4×100%

猴頭菇粗多糖提取率(%)=m3÷m4×V2×0.9×10-4×100%

式中：m1為標準曲線上查得猴頭菇水提物溶液中含糖量，單位為ug；m2為猴頭菇水提物質量，單位為g；V1為猴頭菇水提物溶液定容體積，單位為mL；m3為標準曲線上查得猴頭菇粗多糖溶液中含糖量，單位為ug；m4為猴頭菇樣品質量，單位為g；V2為猴頭菇水提物溶液定容體積，單位為mL；0.9為葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數。

1.5 數據處理

采用Excel 2021 、SPSS Statistics 26對數據進行分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 提取方式對猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響

由圖2可知，與無處理組比較，微波處理組、超聲波處理組、超聲波-微波協同處理組猴頭菇水提物提取率與粗多糖含量顯著增加(P<0.05)，超聲波處理組水提物提取率顯著高于其他處理，超聲波-微波協同處理組水提物中粗多糖含量最高，但與超聲波處理組無顯著差異。超聲波處理組猴頭菇粗多糖提取率達4.19%，與黃越等[14]用超聲波輔助提取法相比粗多糖提取率提高0.27%。因此后續試驗選擇超聲輔助提取方法提取猴頭菇粗多糖。

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.2 不同益生菌發酵對猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響

由圖3可知，與未加菌種組相比較，嗜酸乳桿菌發酵組與酵母菌(高糖型)發酵組水提物提取率顯著減小(P<0.05)，長雙歧桿菌發酵組水提物提取率相較未加菌種組無顯著差異。經過長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌與酵母菌(高糖型)發酵后，猴頭菇水提物中粗多糖含量與粗多糖提取率都顯著提高(P<0.05)，其中粗多糖提取率分別提高5.31%、7.36%和3.15%。因此后續試驗選擇長雙歧桿菌來發酵猴頭菇。

2.3 料液比對猴頭菇粗多糖提取率的影響

由圖4可知，隨著料液比的增加，猴頭菇水提物與粗多糖提取率都隨之降低，料液比為1∶20時粗多糖提取率最高，達到9.43%，這可能是由于水增加導致溶液中長雙歧桿菌濃度下降，發酵作用減小，溶出效率變慢。料液比為1∶25時溶液黏稠且猴頭菇粉末不易溶解易掛壁，結合水提物含量與水提物中多糖含量的結果可知1∶20的料液比最佳，得到的多糖含量最多。

圖4 料液比對猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響

2.4 發酵時間對猴頭菇粗多糖提取率的影響

由圖5可知，隨著發酵時間增加，猴頭菇水提物提取率無顯著變化，而粗多糖含量與粗多糖提取率呈先上升后下降趨勢，這可能因為長雙歧桿菌在發酵前期主要消耗猴頭菇中的還原糖、蛋白質，隨著時間延長，長雙歧桿菌開始分解猴頭菇多糖，導致水提物中粗多糖含量減少[15]，在發酵8 h時，猴頭菇粗多糖提取率達到最大值為13.55%。

圖5 發酵時間對猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響

2.5 發酵溫度對猴頭菇粗多糖提取率的影響

由圖6可知，隨著發酵溫度的增加，猴頭菇水提物提取率的影響相對較小，且沒有顯著關系。而水提物中粗多糖含量與粗多糖提取率呈先升高后降低的趨勢，當發酵溫度為42℃時，猴頭菇粗多糖溶出率最高，最高值為13.01%。溫度過低會使長雙歧桿菌生長緩慢，溫度過高會使長雙歧桿菌活性降低，生長代謝能力下降，適宜的溫度會使得菌種活性提高，溶液中脂肪、單糖等營養物質消耗大，使得水提物中粗多糖含量增加[15]。

圖6 發酵溫度對猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響

2.6 長雙歧桿菌添加量對猴頭菇粗多糖提取率的影響

由圖7可知，在長雙歧桿菌添加量5%～20%范圍內，隨著添加量增加，猴頭菇水提物提取率及其多糖含量都顯著提高，當長雙歧桿菌添加量為20%時，猴頭菇粗多糖提取率達到14.56%。這可能是增加長雙歧桿菌數量后，發酵作用強度增大，使猴頭菇的細胞壁酶解速度加快，粗多糖更易溶出[16]，猴頭菇粗多糖提取率增加。

圖7 長雙歧桿菌添加量對猴頭菇水提物和粗多糖提取率的影響

2.7 長雙歧桿菌發酵猴頭菇的正交試驗

由表2可知，影響猴頭菇水提物提取率的主次因素依次為添加量>發酵溫度=發酵時間，通過極差分析初步得到猴頭菇水提物提取率最佳方案為A3B3C2，水提物提取率為28.70%。影響水提取物中粗多糖含量的主次因素依次為添加量>發酵時間>發酵溫度，通過極差分析初步得到提取液中粗多糖含量最佳方案為A3B1C2，水提物中粗多糖含量為64.00%。影響猴頭菇粗多糖提取率的主次因素依次為添加量>發酵溫度>發酵時間，通過極差分析初步得到粗多糖提取率最佳方案為A3B1C2，猴頭菇粗多糖提取率17.28%。

表2 長雙歧桿菌發酵猴頭菇L9(33)正交試驗結果

對比最優組合A3B3C2與A3B1C2，猴頭菇水提物提取率分別為28.70%與27.00%，水提取物中粗多糖含量分別為52.18%與64.00%，粗多糖提取率分別為14.98%與17.28%，A3B3C2水提物提取率略微高于A3B1C2，其余指標都低于A3B1C2，因此選擇A3B1C2為最佳發酵工藝，在此最佳工藝條件下進行3次平行試驗，測得水提物提取率平均值為27.85%，水提取物中粗多糖含量平均值為62.87%，粗多糖提取率平均值為17.51%，都與正交試驗中各項結果吻合，表明最佳發酵工藝條件穩定，重復性好。因此最佳發酵工藝如下：長雙歧桿菌添加量為20%、發酵時間4 h、發酵溫度42℃。

2.8 不同益生菌處理對猴頭菇粗多糖總抗氧化能力的影響

由圖8可知，酵母菌發酵后的多糖總抗氧化能力最高，達到6.07 umol·g-1。除酵母菌組外的其他3組之間沒有顯著關系，表明長雙歧桿菌與嗜酸乳桿菌發酵對猴頭菇粗多糖的總抗氧化能力沒有顯著影響。益生菌在發酵過程中可水解一些結合酚，釋放游離酚，提高生物利用率，同時降低多糖分子量，從而提高抗氧化能力[17]，而不同菌種水解效率不同，導致總抗氧化能力各不相同。

圖8 添加不同益生菌猴頭菇多糖的總抗氧化能力

2.9 不同益生菌發酵對猴頭菇粗多糖傅立葉紅外光譜影響

由圖9可知，4個處理粗多糖的紅外光譜在500～2200 cm-1和3000～4000 cm-1處基本相似，說明具有相似的官能團，在3300 cm-1～3500 cm-1附近處出現吸收峰，說明在多糖中含有O-H伸縮振動吸收峰，說明其存在分子內或分子間的氫鍵[18]。在1587 cm-1附近出現C=O吸收峰，說明該物質中含有酯酰基結構[19]。在1357 cm-1附近出現C-H變角振動吸收峰，在1075 cm-1附近出現由酯鍵(-COOR)中C-O伸縮振動引起的吸收峰，說明其含有糖醛酸基團。在770 cm-1附近出現α構型C-H面外彎曲振動吸收峰[20]。不同猴頭菇粗多糖的紅外光譜之間沒有明顯的差異，只是峰的位置與強度略微改變，但未使得吸收峰出現變化，這與溫雅慧[21]提取的猴頭菇多糖紅外光譜圖中特征峰的位置相似。這可能是因為益生菌發酵后的多糖分子量減少導致的[22]，有研究表明多糖的生物活性與其結構變化有關[23]，這可能改善多糖的生物活性。

3 結論

益生菌菌株嗜酸乳桿菌、長雙歧桿菌和酵母(高糖型)發酵猴頭菇后降低了猴頭菇水提取物的提取率，但水提物中粗多糖含量與粗多糖提取率顯著增加，其中長雙歧桿菌發酵猴頭菇后其粗多糖提取率最高(11.55%)。益生菌發酵猴頭菇的最佳工藝為：長雙歧桿菌添加量為20%、發酵時間4 h、發酵溫度42℃，在此最佳工藝條件下水提物提取率為27.85%，提取物中粗多糖含量為62.87%，粗多糖提取率為17.51%。不同益生菌發酵后制備的猴頭菌粗多糖都具有一定抗氧化能力，是天然抗氧化劑的良好來源，其中酵母發酵后猴頭菌粗多糖提取物具有最高的總抗氧化能力，達6.07 umol·g-1，長雙歧桿菌發酵后的多糖總抗氧化能力與未經益生菌發酵的多糖沒有顯著差異(P<0.05)。傅里葉變換紅外光譜分析顯示，不同益生菌發酵后與未發酵的猴頭菇粗多糖的傅立葉紅外光譜圖基本相似，峰位置略微偏移，具有相似的官能團。

本研究表明長雙歧桿菌發酵可以顯著增加猴頭菌粗多糖提取率，具有良好的抗氧化能力，這為益生菌在食用菌多糖的應用提供了參考，也為進一步開發猴頭菌多糖作為天然抗氧化劑應用于食品和制藥工業提供科學依據。