清解扶正顆粒的制備工藝研究

盧麗莎，李 煌，黃 偉，林久茂，林 雄，潘旭東，陳武進(jìn)

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；4.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122；5.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院，福建 福州 350108）

清解扶正方是福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院協(xié)定方，處方由白花蛇舌草、半枝蓮、炙黃芪、黨參、炙甘草、炒麥芽6 味藥組成，全方標(biāo)本兼顧，攻補(bǔ)兼施，共奏益氣健脾扶正、清熱解毒消癥之功，治療腸癌療效確切，臨床應(yīng)用廣泛，但湯劑服用存在煎煮不便、患者依從性差等問題。本研究應(yīng)用現(xiàn)代制藥技術(shù)，優(yōu)化清解扶正顆粒提取、成型工藝。考慮到半枝蓮為清解扶正方的君藥，其指標(biāo)性成分為野黃芩苷。研究表明：野黃芩苷具有良好的抗腫瘤活性［1］，其通過hedgehog 信號(hào)通路抑制結(jié)腸腫瘤干細(xì)胞分化［2］，對(duì)結(jié)直腸癌、人乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、人舌鱗癌等都有一定的治療作用。所以把野黃芩苷含量和干浸膏得率綜合評(píng)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選清解扶正顆粒的最佳提取工藝［3］。本研究采用正交實(shí)驗(yàn)法，結(jié)合高效液相色譜法測(cè)定處方中野黃芩苷含量，通過提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比3 個(gè)因素對(duì)清解扶正處方的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳提取工藝，在此基礎(chǔ)上，以成型率、堆密度、休止角、含水量、溶化性、吸濕率等為指標(biāo)，開展成型工藝研究，以期為清解扶正顆粒劑的深入開發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

YH-M6002 電子天平（東陽市英衡智能設(shè)備有限公司）；DHG-9240 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；KQ-500DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；安捷倫HPLC1260 高效液相色譜儀（杭州瑞析科技有限公司）；UV 檢測(cè)器（美國DIONEX 公司）；AR2140 分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］。

半枝蓮（產(chǎn)地：安徽省阜陽市，批號(hào)：210301）、炙甘草（產(chǎn)地：內(nèi)蒙古包頭，批號(hào)：201201）均購自北京本草方源（亳州）藥業(yè)科技有限公司；白花蛇舌草（北京仟草中藥飲片有限公司，產(chǎn)地：江西，批號(hào)：201211002）；炙黃芪（福建咸康藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地：甘肅，批號(hào)：3122020012）；黨參（產(chǎn)地：甘肅，批號(hào)：2104211）、炒麥芽（產(chǎn)地：安徽，批號(hào)：2104233）均產(chǎn)自安徽普仁中藥飲片有限公司；以上中藥飲片購自閩侯縣上街致誠醫(yī)藥商店，由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院林雄主任中藥師鑒定符合《中華人民共和國藥典：四部》［4］120-4802020 版規(guī)定。磷酸（批號(hào)：20201021）、甲醇（批號(hào)：20141218）均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三乙胺（西隴科學(xué)股份有限公司，批號(hào)：1909121）；野黃芩苷對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：B21478）；糊精（批號(hào)：210404）、可溶性淀粉（批號(hào)：210504）均購自漢中泰發(fā)糊精有限責(zé)任公司；乳糖（鎮(zhèn)江市康富生物工程有限公司，批號(hào)：20210914）。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝研究

2.1.1 提取方法 稱取適量處方比例的藥材，加入一定比例的蒸餾水，加熱回流，冷卻至室溫，過濾，收集提取液，定容。

2.1.2 干浸膏得率測(cè)定 移液管精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下得到的液體于恒重蒸發(fā)皿中，水浴鍋蒸干后，移到105 ℃恒溫干燥箱中加熱4 h，迅速取出置于干燥器中冷卻至室溫，反復(fù)測(cè)定至恒重，精密稱重，計(jì)算干浸膏得率。

干浸膏得率＝（干浸膏重量/凈藥材重量）×100%

2.1.3 野黃芩苷含量測(cè)定

2.1.3.1 色譜條件 色譜柱：Galaksil?EF-C18M 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A甲醇-B 0.1%磷酸水（三乙胺調(diào)pH 值至6.0）；梯度洗脫（0～15 min，67.5% B；15～16 min，67.5%～20% B；16～26 min，20% B；26～27 min，20%～67.5% B；27～30 min，67.5% B）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：323 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：40 ℃。理論板數(shù)按野黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于1 500，且分離度良好［5］。

2.1.3.2 供試品溶液制備 取“2.1.2”項(xiàng)下方法所獲得的干浸膏于錐形瓶中，用適量的純甲醇溶解，超聲提取60 min，搖勻，濾過，取濾液即得［6］。

2.1.3.3 野黃芩苷對(duì)照品溶液制備 精密稱取野黃芩苷對(duì)照品適量，加入甲醇溶液，配制成0.04、0.12、0.17、0.20、0.30 mg/mL 的野黃芩苷對(duì)照品溶液，備用。

2.1.3.4 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1.3.3”項(xiàng)下各濃度野黃芩苷對(duì)照品溶液于錐形瓶中，每個(gè)濃度各3 瓶，進(jìn)行平行對(duì)照，按“2.1.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行洗脫，得到對(duì)應(yīng)的峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。野黃芩苷含量：Y＝16 890X－417.06，r＝0.997 1，結(jié)果表明野黃芩苷含量在0.04～0.30 mg/mL 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3.5 專屬性試驗(yàn) 取供試品溶液、野黃芩苷對(duì)照品溶液和缺半枝蓮陰性對(duì)照溶液各10 μL，按“2.1.3.1”中規(guī)定的色譜條件進(jìn)行測(cè)定分析，結(jié)果見圖1。圖1 可見陰性對(duì)照溶液在野黃芩苷色譜峰保留時(shí)間處無吸收，表明處方中其他藥味無干擾。

圖1 野黃芩苷HPLC 色譜圖

2.1.3.6 精密度試驗(yàn) 按照“2.1.3.1”中的色譜條件，將“2.1.3.3”項(xiàng)下野黃芩苷對(duì)照品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6 次。通過對(duì)野黃芩苷的色譜峰面積進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得RSD 為0.26 %，說明有較好的精密度，滿足含量測(cè)定的要求。

2.1.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次清解扶正顆粒樣品，按“2.1.3.2”項(xiàng)下方法制備得到供試品溶液，分別在制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算野黃芩苷含量的RSD 為1.17 %，結(jié)果表明野黃芩苷在制備好的24 h 之后穩(wěn)定性下降。

2.1.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次的清解扶正顆粒樣品6 份，每份3 g，按“2.1.3.2”項(xiàng)下方法制備得到供試品溶液，測(cè)定峰面積，計(jì)算野黃芩苷含量的RSD 為0.51 %，表明重復(fù)性良好。

2.1.3.9 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取清解扶正顆粒3 g共6 份，分別加入含有1.50 mg/mL 野黃芩苷的對(duì)照品溶液1 mL，按照“2.1.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算得野黃芩苷平均回收率為97.99 %，RSD 為2.17 %。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.1.4 加熱回流提取工藝的單因素考察

2.1.4.1 提取時(shí)間考察 稱取適量清解扶正方藥材，分別將提取時(shí)間設(shè)置為30、60、75、90、120、150 min，用1∶10 的料液比加熱回流提取1 次，結(jié)果見表2。

表2 提取時(shí)間考察結(jié)果（n＝3）

從表2 野黃芩苷含量以及干浸膏得率的綜合評(píng)分中可以看出：提取時(shí)間為30、60、90 min 的綜合評(píng)分較高。因此選擇30、60、90 min 作為正交實(shí)驗(yàn)提取時(shí)間考察的3 個(gè)水平。

2.1.4.2 料液比考察 為確定提取時(shí)的加水量，分別設(shè)置1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15、1∶20 共6 組料液比，提取1 次，提取時(shí)間為60 min，結(jié)果見表3。

表3 料液比考察結(jié)果（n＝3）

從表3 野黃芩苷含量以及干浸膏得率的綜合評(píng)分中可以看出：料液比為1∶15、1∶12、1∶10 的綜合評(píng)分較高。因此把1∶10、1∶12、1∶15 作為正交實(shí)驗(yàn)料液比考察的3 個(gè)水平。

2.1.5 正交試驗(yàn) 用加熱回流法提取清解扶正方，以提取時(shí)間（A）、提取次數(shù)（B）、料液比（C）為考察因素，按L9（34）正交表［7］設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，共9 組，平行3 組，對(duì)以上主要參數(shù)進(jìn)行工藝優(yōu)化，表4 為3 因素、3 水平正交表，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5，對(duì)3 因素、3 水平正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6。

表4 正交試驗(yàn)因素水平表

表5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

表6 方差分析結(jié)果

表5 顯示：在所選定的3 個(gè)因素中，提取次數(shù)對(duì)干浸膏得率影響最大，3 個(gè)因素對(duì)干浸膏得率的影響程度為B＞A＞C，優(yōu)選工藝為A3B2C2。表6 顯示：各因素對(duì)野黃芩苷含量、干浸膏得率的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），對(duì)生產(chǎn)時(shí)間、能耗以及各水平間的差距等因素綜合考慮后，認(rèn)為此優(yōu)選工藝可行性較高，所以將提取工藝確定為A3B2C2，即以1∶12 為料液比，加熱回流2 次，每次1.5 h。

2.1.6 正交實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證 為了進(jìn)一步確定所選提取條件的科學(xué)準(zhǔn)確性，按“2.1.5”項(xiàng)下的最佳提取工藝，制備3批清解扶正提取液，批次分別為1批、2批、3 批，測(cè)定的野黃芩苷含量RSD 為0.98%，干浸膏得率RSD 為0.41%，說明該提取工藝穩(wěn)定性良好，可行性高。結(jié)果見表7。

表7 正交試驗(yàn)驗(yàn)證數(shù)據(jù)表（n＝3）

2.2 成型工藝研究 稱取適量清解扶正處方藥材，采用第“2.1”項(xiàng)下確定的最佳提取工藝提取藥材。將提取液過濾后，合并2 次濾液，濾液濃縮至對(duì)應(yīng)的相對(duì)密度，即得清解扶正稠膏（以下簡稱稠膏）。取適量稠膏，加入輔料，將二者混合到“握之成團(tuán)，觸之即散”的狀態(tài)，在16 目篩上制粒，干燥箱中60 ℃干燥，取出，在干燥器中放冷后，再以10 目篩和80 目篩整粒，即得清解扶正顆粒（以下簡稱顆粒）。

2.2.1 稠膏相對(duì)密度的考察 分別精密稱取溫度為55 ℃不同相對(duì)密度的稠膏10 g，加入與稠膏用量比例為1∶1.5～2 的不同類型輔料使之成型后，記錄其過篩容易度、成型性和外觀性狀，結(jié)果見表8。

表8 稠膏相對(duì)密度考察結(jié)果

從表8 的結(jié)果可知：稠膏相對(duì)密度為1.28 g/mL時(shí)，顆粒的過篩容易度、成型性和外觀形狀較好，故將稠膏濃縮到相對(duì)密度1.28 g/mL 用于制粒。

2.2.2 輔料種類及用量比例考察 目前制備顆粒劑可用的輔料有乳糖、可溶性淀粉、糊精、微晶纖維素、蔗糖、糖粉、硫酸鈣、甘露醇等，由于在預(yù)試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)以微晶纖維素為輔料制成的顆粒溶化性差，所以本實(shí)驗(yàn)選用乳糖、可溶性淀粉、糊精3 種輔料，探究其與稠膏的成型關(guān)系及最佳用量比例。

取相對(duì)密度為1.28 g/mL 的稠膏30 g 與輔料混合，以過篩容易度、顆粒均勻度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探究最佳輔料種類及稠膏與輔料的用量比例，以表9 為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見表10。

表9 顆粒評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)表

表10 輔料種類及用量比例考察結(jié)果

通過過篩容易度、顆粒均勻度得分，并遵循輔料最少原則，確定最佳輔料為可溶性淀粉。并以得分最高的稠膏、輔料比分為3 組，分別為1 組（1∶1.42）、2 組（1∶1.52）、3 組（1∶1.54）。

2.2.3 評(píng)價(jià)指標(biāo) 分別檢測(cè)“2.2.2”項(xiàng)下確定的3 組清解扶正顆粒的成型率、堆密度、休止角、溶化性、吸濕率、含水量，評(píng)價(jià)3 組清解扶正顆粒的成型工藝。

2.2.3.1 成型率 依照《中華人民共和國藥典：四部》［4］145中的成型率測(cè)定法，采用手動(dòng)雙篩分法，稱取清解扶正顆粒10～15 g，倒入上層為1 號(hào)篩、下層為5 號(hào)篩的雙篩中，水平左右篩動(dòng)拍打3 min，取能過1 號(hào)篩并不能過5 號(hào)篩的顆粒稱重，計(jì)算其成型率。

成型率＝（過篩后顆粒質(zhì)量/過篩前顆粒質(zhì)量）×100%

2.2.3.2 堆密度 參照《中華人民共和國藥典：四部》［4］151，將一定量過篩后的清解扶正顆粒放入干燥的量筒中，輕輕振動(dòng)后，讀出其近刻度處的數(shù)值作為V（mL），將過篩后的顆粒質(zhì)量作為M（g），兩者比值即為堆密度。

堆密度/（g/mL）＝M/V。

2.2.3.3 休止角 采用固定漏斗法，將漏斗固定于距濾紙高度為H 處，緩慢將顆粒沿漏斗壁倒入，直到紙上形成的顆粒圓錐體尖端接觸到漏斗口為止，測(cè)出圓錐底部的半徑（R），計(jì)算圓錐和濾紙間所形成的角度即為休止角α。

tgα＝H/R。

2.2.3.4 溶化性 取清解扶正顆粒5 g，加入100 mL熱水中，攪拌5 min，立即觀察是否完全溶化［8］。

2.2.3.5 吸濕率 將底部盛有氯化鈉過飽和溶液的玻璃干燥器放入25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫24 h，此時(shí)干燥器內(nèi)的相對(duì)濕度為75%。在已恒重的稱量瓶底部放入清解扶正顆粒，準(zhǔn)確稱重后置于氯化鈉過飽和溶液的玻璃干燥器內(nèi)（稱量瓶蓋打開），于25℃恒溫培養(yǎng)箱保存，72 h 后稱量，計(jì)算吸濕率［9］。

吸濕率＝（吸濕后顆粒質(zhì)量－吸濕前顆粒質(zhì)量）/吸濕前顆粒質(zhì)量×100%

2.2.3.6 含水量 參照《中華人民共和國藥典：四部》［4］1114水分測(cè)定法（烘干法）：取2～5 g 清解扶正顆粒，重量為W1（g），平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，稱量瓶重量為W2（g），厚度不超過5 mm，精密稱定，開啟瓶蓋在100～105 ℃干燥5 h，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，放冷30 min，精密稱定，再在上述溫度干燥1 h，放冷，稱重，至連續(xù)兩次稱重的差異不超過5 mg 為止，此時(shí)稱量瓶+清解扶正顆粒重量為W3（g）。根據(jù)減失的重量，計(jì)算清解扶正顆粒中含水量。

含水量＝（W1＋W2－W3）/W1×100%

2.2.3.7 成型工藝評(píng)價(jià)結(jié)果 把成型率、休止角、堆密度的綜合評(píng)分作為考察指標(biāo)，各權(quán)重系數(shù)分別為50%、25%、25%，綜合評(píng)分為各項(xiàng)數(shù)值乘以權(quán)重系數(shù)，進(jìn)行清解扶正顆粒的成型工藝優(yōu)選。3 組清解扶正顆粒的綜合評(píng)分結(jié)果見表11。

表11 成型工藝的綜合評(píng)分

由表11 可知：3 組的成型率良好；顆粒堆密度小，顆粒間的空隙小，本品流動(dòng)性好，易于分裝，可避免顆粒裝量差異［10］；3 次測(cè)定的結(jié)果均符合中藥顆粒劑在《中華人民共和國藥典：四部》［4］1114中水分測(cè)定法（通則0832）測(cè)定的規(guī)定；3 組顆粒都完全溶于熱水，且吸濕率良好。

3 討 論

目前顆粒劑制備可用的輔料有乳糖、可溶性淀粉、糊精、微晶纖維素、蔗糖、糖粉、硫酸鈣、甘露醇等，前期在輔料種類的篩選時(shí)，發(fā)現(xiàn)該處方浸膏添加微晶纖維素所制成的顆粒劑溶化性極低，所以在輔料選擇中排除微晶纖維素。由于實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)較黏稠膏與糊精混合會(huì)降低顆粒過篩容易度，與乳糖混合會(huì)增大患者服藥量，因此選擇可溶性淀粉作為輔料。

本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)法，結(jié)合高效液相色譜法建立了清解扶正提取液中野黃芩苷的含量測(cè)定方法，分別對(duì)清解扶正處方的提取時(shí)間、料液比和提取次數(shù)3 個(gè)因素進(jìn)行考察，以L9（34）正交表設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化清解扶正提取工藝，得到的最佳提取工藝為料液比1∶12，加熱回流提取2 次，每次1.5 h，分別制備3 批樣品，驗(yàn)證該工藝的重現(xiàn)性良好。高效液相色譜法快速、簡單、方便、準(zhǔn)確，易于操作，一般實(shí)驗(yàn)室條件均可滿足，可用于清解扶正顆粒的質(zhì)量研究，為以后的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)［11］。

在最佳提取工藝基礎(chǔ)上，探究清解扶正顆粒成型工藝。因?yàn)槌尚吐试礁叽砉に囋胶茫栽诰C合測(cè)評(píng)中成型率的權(quán)重應(yīng)占最大［12］。休止角指粉體堆積層的自由斜面與水平面所形成的最大角，休止角越小，摩擦力越小，粉體流動(dòng)性越好。粉體的流動(dòng)性對(duì)顆粒劑的重量差異及正常操作影響較大，所以將休止角作為綜合測(cè)評(píng)的因素之一。堆密度與粉體顆粒間的致密程度有關(guān)，其對(duì)于顆粒的計(jì)量與運(yùn)輸有一定影響［13］，所以將堆密度作為綜合測(cè)評(píng)的因素之一。因此把成型率、休止角、堆密度的綜合評(píng)分作為考察指標(biāo)，各權(quán)重系數(shù)分別為50%、25%、25%，綜合評(píng)分為各項(xiàng)數(shù)值乘以權(quán)重系數(shù)，進(jìn)行清解扶正顆粒的成型工藝優(yōu)選。

通過對(duì)清解扶正顆粒成型工藝的探究，比較幾種輔料分別與不同相對(duì)密度稠膏混合的評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果表明用相對(duì)密度為1.28 g/mL 的稠膏與可溶性淀粉成1∶1.42 比例混合，制備出的顆粒粒度適中，外觀均勻，溶化性好，綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)高，穩(wěn)定可靠。