肉蓯蓉骨靶向納米制劑治療大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的實(shí)驗(yàn)研究

儲(chǔ)建函，梁子聰，陳其寬，2

[1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，貴州 都勻 558013；2.黔南州中醫(yī)醫(yī)院(黔南民族醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校第二附屬醫(yī)院)，貴州 都勻 558000]

骨質(zhì)疏松癥(OP)是一種以骨密度降低，骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征的全身性骨病。該病主要導(dǎo)致骨脆性增加，最嚴(yán)重的并發(fā)癥是骨質(zhì)疏松性骨折[1]。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病與年齡、性別密切相關(guān)，常見(jiàn)于老年人，尤其是絕經(jīng)后婦女[2]。全國(guó)第七次人口普查結(jié)果顯示，我國(guó)目前60歲及以上人口共為2.64億人，約占全國(guó)人口總數(shù)18.7%。隨著人口老齡化問(wèn)題日益嚴(yán)重，骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療已成為我國(guó)亟待解決的公共衛(wèi)生問(wèn)題[3]。目前，骨質(zhì)疏松癥的治療主要以雙磷酸鹽類(lèi)藥物等骨吸收抑制劑，藥物療效雖然較好，但有明顯的不良反應(yīng)，研究毒副作用小的替代藥必將成為未來(lái)新方向[4]。靶向藥物具有靶向器官藥物濃度高、全身副作用小的優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于腫瘤等疾病的治療[5]。肉蓯蓉現(xiàn)被臨床用作治療骨質(zhì)疏松癥，為充分挖掘其最佳療效，本研究觀察肉蓯蓉骨靶向納米制劑對(duì)卵巢切除致骨質(zhì)疏松癥大鼠的影響，為該制劑的進(jìn)一步研發(fā)與應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組 購(gòu)買(mǎi)雌性SD大鼠60只，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成6組，分別設(shè)立假手術(shù)組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、肉蓯蓉醇提液組、肉蓯蓉納米粒組、肉蓯蓉骨靶向納米粒組，每組10只。

1.2 主要試劑與儀器 抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)檢測(cè)試劑盒(上海碧云天)，堿性磷酸酶(ALP)檢測(cè)試劑盒、鈣測(cè)試盒和磷測(cè)試盒(南京建成)，大鼠骨保護(hù)素(OPG)和核因子kB受體活化因子配體(RANKL)免疫組化一抗、DAB 顯色試劑盒(武漢博士德)。

1.3 藥物制備

1.3.1 肉蓯蓉納米粒及骨靶向納米粒的制備 (1)肉蓯蓉納米微粉的制作：將肉蓯蓉飲片在干燥箱內(nèi)干燥，采用球磨機(jī)加工得到肉蓯蓉微粉；稱(chēng)取微粉5 g，于混合球磨樣儀加工，即得不同粒徑的納米粉末。(2)參考文獻(xiàn)方法制備四環(huán)素骨靶向納米粒[6]。(3)采用乳化溶劑揮發(fā)法制備載藥納米粒：精密稱(chēng)取20 mg四環(huán)素-PLGA2000(用于四環(huán)素骨靶向納米粒制備)，與上述制備藥物混合，加入二氯甲烷和聚乙烯醇乳化，蒸發(fā)去除二氯甲烷，制備得到肉蓯蓉骨靶向納米粒。肉蓯蓉納米粒的合成與肉蓯蓉骨靶向納米粒合成方法相同。

1.3.2 肉蓯蓉醇提液制備 將肉蓯蓉飲片打粉過(guò)篩后，加入75%乙醇溶液利用索氏提取器，回流提取4 h，共提取2次，合并2次提取液，置于負(fù)壓的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，60℃濃縮至生藥量為1 g/ml。

1.4 大鼠骨質(zhì)疏松模型的建立 除假手術(shù)組外，SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用卵巢切除法建立大鼠骨質(zhì)疏松模型[7]：1%戊巴比妥鈉(4 ml/kg)腹腔麻醉后，腹部備皮消毒后沿正中切開(kāi)，探查腹腔并將子宮角末端脂肪團(tuán)拉出腹腔，用止血鉗將卵巢結(jié)扎并切除，然后將組織還原，同樣的法切除另一側(cè)卵巢，最后依次縫合傷口。假手術(shù)組大鼠僅切除卵巢旁邊相同大小的脂肪組織。

1.5 給藥 術(shù)后4周開(kāi)始給藥，將去勢(shì)大鼠隨機(jī)分成6組，每組10只，以假手術(shù)組、模型組作為對(duì)照。(1)假手術(shù)組、模型對(duì)照組，給予等劑量生理鹽水；(2)陽(yáng)性對(duì)照組[鈣爾奇組，按277.3 mg/(kg·d)給藥]；(3)醇提液組，按0.5 mg/(kg·d)給藥(按生藥劑量計(jì)算)；(4)納米粒組，按0.5 mg/(kg·d)給藥(按生藥劑量計(jì)算)；(5)骨靶向納米粒組，按0.5 mg/(kg·d)給藥(按生藥劑量計(jì)算)。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 血清 Ca2+，P，ALP，TRACP含量檢測(cè) 連續(xù)給藥2個(gè)月后，麻醉處死大鼠，股動(dòng)脈取血，離心取血清。參照試劑盒方法，分別檢測(cè)血清Ca2+，P，ALP及TRACP含量。

1.6.2 脛骨顯微CT掃描 大鼠處死后，每組隨機(jī)各選4只，取其左脛骨近端，置于10%福爾馬林保存，后取出用清水洗凈殘?jiān)眉啿及笾糜陲@微CT下掃描，掃描層分辨率30 μm，三維重建關(guān)節(jié)處影像，利用三維影像軟件計(jì)算軟骨下骨骨小梁的厚度(Tb.Th)、數(shù)目(Tb.N)、間距(Tb.Sp)、骨量體積比(BV/TV)的改變。

1.6.3 免疫組化檢測(cè)骨組織中OPG、RANKL表達(dá) 取出蠟塊，依次切片、脫水、抗原修復(fù)，加一抗、二抗，加DAB顯色，脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。免疫組化切片置于40倍顯微鏡下，每例取臨近軟骨退變區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)不重疊視野進(jìn)行處理，測(cè)定陽(yáng)性顆粒平均灰度值，取每張切片的均值作為每例的測(cè)量值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清 Ca2+，P，ALP，TRACP含量檢測(cè) 與假手術(shù)組相比，模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、醇提液組血清 Ca2+含量降低(P<0.05)，而納米粒組、骨靶向納米粒組血清 Ca2+含量稍降低，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組相比，納米粒組、骨靶向納米粒組血清 Ca2+含量升高(P<0.05)。與假手術(shù)組相比，模型對(duì)照組血清P含量升高(P<0.05)；與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、醇提液組、納米粒組、骨靶向納米粒組血清P含量降低(P<0.05)。與假手術(shù)組相比，其余各組血清ALP含量升高(P<0.05)；與模型對(duì)照組相比，骨靶向納米粒組血清ALP含量降低(P<0.05)。與假手術(shù)組相比，其余各組血清TRACP含量升高(P<0.05)；與模型對(duì)照組相比，醇提液組、納米粒組、骨靶向納米粒組血清TRACP含量有不同程度降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清 Ca2+，P，ALP，TRACP含量檢測(cè)結(jié)果的比較

2.2 各組大鼠脛骨顯微CT掃描結(jié)果 與假手術(shù)組相比，其余各組Tb.Th不同程度降低(P<0.05)；與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、醇提液組、納米粒組、骨靶向納米粒組Tb.Th不同程度升高(P<0.05)；與陽(yáng)性對(duì)照組、醇提液組相比，納米粒組、骨靶向納米粒組Tb.Th不同程度升高(P<0.05)。與假手術(shù)組相比，模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組Tb.N不同程度降低(P<0.05)；與模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組相比，醇提液組、納米粒組、骨靶向納米粒組Tb.N不同程度升高(P<0.05)；與醇提液組、納米粒組相比，骨靶向納米粒組Tb.N升高(P<0.05)。與假手術(shù)組相比，模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、醇提液組、納米粒組Tb.Sp不同程度升高(P<0.05)，骨靶向納米粒組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型對(duì)照組相比，醇提液組、納米粒組、骨靶向納米粒組Tb.Sp不同程度降低(P<0.05)。與假手術(shù)組相比，模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、醇提液組、醇納米粒組BV/TV不同程度降低(P<0.05)，骨靶向納米粒組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型對(duì)照組相比，醇提液組、納米粒組、骨靶向納米粒組BV/TV不同程度升高(P<0.05)；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，骨靶向納米粒組BV/TV升高(P<0.05)；與醇提液組相比，納米粒組、骨靶向納米粒組BV/TV不同程度升高(P<0.05)；與納米粒組相比，骨靶向納米粒組BV/TV升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠脛骨顯微CT掃描結(jié)果的比較

2.3 各組大鼠骨組織中OPG、RANKL的相對(duì)表達(dá)結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、醇提液組、納米粒組、骨靶向納米粒組大鼠骨組織中OPG的相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)；與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、醇提液組、納米粒組、骨靶向納米粒組大鼠骨組織中OPG的相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，納米粒組、骨靶向納米粒組大鼠骨組織中OPG的相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)；與醇提液組相比，納米粒組、骨靶向納米粒組大鼠骨組織中OPG的相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)；與納米粒組相比，骨靶向納米粒組大鼠骨組織中OPG的相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)。與假手術(shù)組相比，模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、醇提液組、納米粒組大鼠骨組織中RANKL的相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)；與模型對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、醇提液組、納米粒組、骨靶向納米粒組大鼠骨組織中RANKL的相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，納米粒組、骨靶向納米粒組大鼠骨組織中RANKL的相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)；與醇提液組相比，骨靶向納米粒組大鼠骨組織中RANKL的相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠骨組織中OPG、RANKL的相對(duì)表達(dá)結(jié)果的比較

3 討論

大量研究表明，絕經(jīng)后婦女發(fā)生骨質(zhì)疏松是由卵巢功能衰退繼發(fā)雌激素缺乏引起的[8]。當(dāng)婦女絕經(jīng)后，體內(nèi)雌激素水平驟然下降，引起成骨細(xì)胞活性下降，破骨細(xì)胞活性上升，體內(nèi)骨代謝平衡破壞，骨破壞超過(guò)骨形成，最終結(jié)果導(dǎo)致骨量減少[9]。除此之外，當(dāng)機(jī)體雌激素不足時(shí)，可直接導(dǎo)致腸鈣吸收障礙或維生素D拮抗引起血鈣降低，促進(jìn)骨流失[10]。

骨質(zhì)疏松癥屬于中醫(yī)學(xué)中“骨萎”的范疇，病因以肝腎虧虛為主。藥理學(xué)研究證實(shí)：肉蓯蓉具有雌激素樣作用，可用于骨質(zhì)疏松癥的治療[11]。故臨床常使用肉蓯蓉治療肝腎虧虛、精氣不足引起的骨質(zhì)疏松癥。本研究使用的是卵巢切除建立骨質(zhì)疏松大鼠模型，卵巢被切除后，大鼠體內(nèi)雌激素水平下降，激活OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路，破骨細(xì)胞活性明顯增強(qiáng)，成骨細(xì)胞活性被抑制，導(dǎo)致骨吸收超過(guò)骨合成，骨質(zhì)中RANKL表達(dá)增加，而OPG表達(dá)減少，最終引起大鼠骨質(zhì)中骨小梁體積變小、數(shù)量減少。TRACP是破骨細(xì)胞分泌的糖基化蛋白酶，TRACP升高反映破骨細(xì)胞活動(dòng)活躍[12]。而ALP是成骨細(xì)胞的一種胞外酶，與成骨細(xì)胞的骨礦化密切相關(guān)，ALP升高則提示骨礦化障礙[13]。本研究結(jié)果顯示，使用肉蓯蓉制劑的骨質(zhì)疏松癥大鼠血清ALP和TRACP含量降低，骨小梁厚度、數(shù)目、體積比增加，并且OPG表達(dá)增強(qiáng)而RANKL表達(dá)降低。該結(jié)果說(shuō)明服用肉蓯蓉制劑可一定程度逆轉(zhuǎn)雌激素水平下降所致的骨吸收作用，而且較單純使用鈣制劑效果更好。肉蓯蓉骨靶向納米粒組在治療大鼠卵巢切除致骨質(zhì)疏松癥較肉蓯蓉醇提液組和肉蓯蓉納米粒組效果更好。這可能與肉蓯蓉骨靶向納米粒使用PLGA納米載體，減少藥物在血液中被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，增加藥物的循環(huán)時(shí)間相關(guān)。而且四環(huán)素能特異性與骨結(jié)合，其介導(dǎo)骨靶向使藥物在骨組織中藥物濃度更高，作用周期更長(zhǎng)。

綜上所述，肉蓯蓉骨靶向納米制劑對(duì)大鼠卵巢切除致骨質(zhì)疏松癥效果明顯，可能是今后治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的一個(gè)更好選擇。但是，藥物應(yīng)用后骨靶向小分子和納米藥物載體材料對(duì)全身的毒副作用尚未明確，需要進(jìn)一步研究。