新冠病毒SARS-CoV-2主蛋白酶3CLpro抑制劑的多步虛擬篩選

杜宏金,余曉譚,李翰旭,萬洛婷,鄒瑜

(1.國家藥品監督管理局藥品審評中心,北京100038;2.武漢科技大學醫學院藥學系,湖北省職業病預防與控制重點實驗室,湖北 武漢 430070;3.華中科技大學同濟醫學院藥學院,湖北 武漢 430030)

自2019年12月新型冠狀病毒肺炎爆發以來,全球陷入了持續的社會和經濟的混亂。截至2023年4月,全球累計確診病例已超過6億,累計死亡病例超過600萬例。新型冠狀病毒SARS-CoV-2(又名2019-nCoV)是新型冠狀病毒肺炎的致病因子,目前此病毒已變異分化出多種亞型,并且有可能持續變異[1]。因此,我們需要開發出一套,能快速篩選出對新冠病毒有抑制力先導化合物的方法,加快藥物研發進程。

冠狀病毒是一大類單鏈包膜RNA病毒,可分為4大類,其中SARS-CoV-2屬于β屬[2]。冠狀病毒通過刺突蛋白結合表面受體進入宿主細胞[3]。SARS-CoV-2的表面受體是血管緊張素轉換酶2(ACE2)[4]。病毒進入宿主細胞后,其陽性基因組RNA直接附著于宿主核糖體,然后將兩個大的共端多聚蛋白經主蛋白酶加工成相應的組件,用于組裝新的病毒。為了復制RNA基因組,冠狀病毒編碼一種復制酶,它是一種RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)[5]。因此從機制可以看出,SARS-CoV-2靶向藥物的靶標主要包括ACE2,主蛋白酶和RdRp。目前為止,國內已批準的抗新冠主蛋白酶3CLpro抑制劑包括輝瑞公司的奈瑪特韋片/利托那韋片、先聲藥業的先諾特韋片/利托那韋片、廣東眾生睿創生物科技有限公司的來瑞特韋片用于治療輕中度新冠肺炎患者,前兩款藥物為主蛋白酶3CLpro抑制劑與利托那韋組合包裝產品聯合治療產品,后一種藥物為主蛋白酶3CLpro抑制劑單藥治療產品。SARS-CoV-2主蛋白酶的X射線晶體結構已經揭示,為基于結構的藥物發現工作提供了極好的基礎[6]。因此,主蛋白酶是SARS-CoV-2藥物再利用的有希望的靶標。

在本研究中,我們使用SARS-CoV-2的主蛋白酶(PDB ID:6LU7)作為受體蛋白,對來自ZINC 藥物數據庫的5 811個化合物進行了3輪虛擬篩選:基于結構的篩選,基于配體的篩選和基于藥理學的篩選。由此從數據庫中獲得了11個具有高親和力、高擬合值和適當藥理作用的分子。

1 材料與方法

1.1 基于結構的 ZINC 數據集虛擬篩選將來自ZINC 數據庫的 in-trails dataset數據集導入OpenBable工具中,以實現能量最小化,并將SDF文件轉換為PDBQT文件。通過主蛋白中的不可逆共價抑制劑N3定義活性口袋位置以15×15×15的大小、-0.71×12.41×68.83的坐標覆蓋SARS-CoV-2的活性位點,并在綁定的口袋內覆蓋必需殘基,使用AutoDock Vina進行對接。使用Discovery studio Visualizer和Pymol程序確定最佳構象時分子的相互作用和結合模式,根據化合物的對接分數(kcal·mol-1)對化合物進行排名,結合親和力小于-8的化合物被認為是hit化合物。

1.2 基于配體的藥效團模型的構建SARS-CoV-2和SARS-CoV在其解碼的主蛋白酶中具有96%的序列同一性。在催化區域中,兩種蛋白酶之間有差異的大多數殘基在蛋白質表面上。S46(2019-nCoV)/A(SARS-CoV)可能與結合活性位點的底物或抑制劑相互作用。然而,從A到S的微小變化預計不會顯著干擾小分子抑制劑與活性位點的結合。因此,有效抑制SARS-CoV主蛋白酶的抑制劑也有望對SARS-CoV-2的主蛋白酶起類似作用[5]。通過比較和疊加一系列活性相似但結構不同的化合物的特征結構,可以生成一套基于配體的藥效團模型。再通過評價和驗證后,選取最佳的藥效團模型用于虛擬篩選小型化合物數據庫,搜索潛在的藥物[7]?；谟柧毤钚苑肿咏Y構多樣性的原理,我們選取了文獻報道的16種SARS冠狀病毒類主蛋白酶抑制劑構建訓練集(如表1所示)。

根據活性分子的IC50值,我們定義了Principal和Max Omit Feat的性質。對于IC50≤1 μmol·L-1的活性分子,Principal定義為2,確保參考分子在構建藥效團空間時考慮了分子中的所有化學特征,Max Omit Feat定義為0,意味著藥效團模型中的所有特征元素都需要與參考化合物匹配。對于IC50在1 ～ 100 μmol·L-1之間的中等活性分子,Principal定義為1,其中考慮了該分子的構象,Max Omit Feat定義為1,表示藥效團模型中的某個特征元素對于化合物可以省略。選擇疏水性(HYD)特征、氫鍵受體(HBA)、氫鍵供體(HBD)、芳香環中心(RA)作為特征藥效團特征?；谟柧毤肿拥幕钚詷嬒?利用Discovery Studio 2016的共同特征藥效團生成模塊(Common Feature Pharmacophore Generation)構建模型(如圖1所示)。

圖1 16種SARS冠狀病毒類主蛋白酶抑制劑的化學結構

1.3 藥效團模型的評價和驗證能否準確預測分子針對靶標的活性,藥效團模型是關鍵。因此,必須選用合適的方法評價藥效團模型,為此我們構建了一個測試集來比較不同藥效團的識別能力。測試集共包含5 408個分子,分為陽性測試組和陰性測試組。其中陽性測試組的24個分子是隨機選擇的已過生物活性測試的化合物,陰性測試組的5 384個分子取自Drug Like Diverse數據庫。我們使用兩個參數SE(靈敏度)和SP(特異性)來評估藥效團的預測能力。SE值代表模型識別活性分子的能力,SP值代表模型識別非活性分子的能力。兩者的值越接近于 1,表示藥效團的識別能力越強。SE定義為真陽性(TP)與真陽性(TP)和假陰性(FN)之和的比率:SE=[TP/ (TP+ FN)]。SP 定義為真陰性(TN)與真陰性(TN)和假陽性 (FP) 之和的比率:SP=[TN/ (TN+ FP)]。我們使用十個生成的藥效團來篩選陽性測試組和陰性測試組,分別計算出 SP 和SE 值。篩選由Discovery Studio中的Ligand Profile模塊進行,每個化合物產生 200個構象來繪制藥效團。能量閾值設置為 10,以避免不合理的構象;擬合方法設置為靈活,最大省略特征設置為0,這意味著化合物需要映射所有藥效團特征。

1.4 基于配體的數據集虛擬篩選經評價和驗證后,選擇最佳的藥效團模型作為3D query,從分子對接的結果中篩選化合物。參數設置與上一步相同。我們將擬合值的閾值設定為3.5。

1.5 基于藥理學的最終數據集篩選虛擬篩選的計算結果良好并不意味著化合物實際上對SARS-CoV-2有良好的抑制作用。因此,化合物還需要一步的藥理學篩選。我們查詢了上一步篩選出的化合物的全部已報道的藥理作用,并挑選出了所有與抗病毒有關的藥物。

2 結果與討論

2.1 基于結構的虛擬篩選結果虛擬篩選由PyRx執行。我們選擇了結合親和力小于- 8 kcal·mol-1的分子,共有678個分子。

2.2 基于配體的藥理學模型的特點及可靠性驗證我們構建了10個基于配體的藥效團模型,相關參數見表2。綜合考慮SE值和SP值,我們決定選用模型4。

表2 10個藥效團模型的特征、試驗組和試驗結果

TP:真陽性,該化合物既有生物活性,又經藥效團篩選;TN:真陰性,該化合物無生物活性,未被藥效團篩選;FP:假陽性,該化合物沒有生物活性但已被藥效團篩選出來;FN:假陰性,化合物具有生物活性,未被藥效團篩選;SE:靈敏度,SE=[TP/(TP+ FN)];SP:特異性,SP=[TN/(TN+ FP)]。

模型4以HHAA為特征,包含4個HBA和2個HYD。模型4對訓練集的化合物組具有高度敏感性(SE=0.833)和高度特異性(SP=0.840),與訓練集分子匹配良好,因此模型的可靠性很高(如圖2所示)。

氫鍵受體特征顯示為綠色球體,疏水性特征顯示為藍色球體圖2 訓練化合物CHEMBL242436繪制的藥效團模型4

2.3 基于配體的虛擬篩選結果和基于藥理學的篩選結果模型 4 用作 3D query來篩選步驟 1 中的化合物庫,共有484個分子通過了篩選。Fit 值大于3.5的分子有137個。在經過基于藥理學的篩選之后,剩下11個分子(如表3所示)。

表3 最終篩選出的11種化合物的計算結果和藥理作用

表6 含量測定結果(mg/100 g,n=2)

3 結論

COVID-19 的爆發引起了全世界的恐慌、社會和經濟的混亂,并且疫情仍在全球蔓延。對已上市藥物進行計算機虛擬篩選從而發現抗SARS-CoV-2 藥物為一種快速而經濟的方法。因此,我們選擇ZINC的in-trials 數據集作為我們的篩選數據集,建立多重篩選的方法尋找潛在的抗SARS-CoV-2藥物。

本研究中,我們使用由3個步驟組成的虛擬篩選工作流程來篩選數據庫,并確定11種潛在抑制劑。這3個步驟包括基于結構的虛擬篩選、基于配體的虛擬篩選和基于藥理學的篩選。這些藥物大部分是抗病毒藥物,不僅與SARS-Cov-2主蛋白酶有很好的親和力,而且與藥效團模型有很好的擬合。

至此,我們的研究在一方面可以大大縮小藥物篩選的范圍,因為它們可以盡快進行體外實驗,以確定它們對SARS-CoV-2是否具有抑制作用;另一方面,我們提供了一組可用于虛擬篩選的方法和模型,對其他類似的藥物虛擬篩選具有借鑒意義。未來我們可以使用更大的數據庫進行虛擬篩選,從而加速人類尋找針對 COVID-19 的有效藥物的過程。