淫羊藿多糖提取、分離純化、結構特征和生物活性研究進展

邢中夫,于慧,萬新煥

(山東中醫藥大學藥學院,山東 濟南 250355)

淫羊藿(EpimediumbrevicornumMaxim.)是小檗科(Berberidacea)淫羊藿屬(Epimedium)草本植物,在很多古代藥籍中均有記載。淫羊藿又名仙靈脾、棄杖草,始載于《神農本草經》,常生于林下、溝邊灌叢中或山坡陰濕處,其產地主要為四川、陜西、貴州、湖南等地[1]。淫羊藿中化學成分主要分為黃酮類、多糖類、生物堿類等[2],具有補肝腎、抗氧化、衰老、腫瘤等功效,并且在機體內具有強筋骨、調節免疫等臨床治療作用[3-8],臨床應用十分廣泛。文獻表明,中藥材淫羊藿主要有淫羊藿、朝鮮淫羊藿、箭葉淫羊藿、巫山淫羊藿、粗毛淫羊藿、柔毛淫羊藿等類別的干燥葉[9],其差別主要體現在形態與性質,如朝鮮淫羊藿中多糖成分的含量與抗氧化活性要明顯高于其他種類[10]。淫羊藿多糖(Epimediumpolysaccharides,EPS)是對淫羊藿藥材進行分離獲得的具有活性的雜多糖,是淫羊藿物質基礎的主要組分之一,現代研究表明淫羊藿多糖具有多種豐富的生物活性,如調節自身免疫力、抗病毒、抗衰老、抗氧化、抗輻射等生物活性[11-16]。文章基于淫羊藿多糖的提取分離、純化方法、生物活性以及結構等方面的研究進展完成綜述,為淫羊藿多糖的進一步的使用開發提供一定的理論依據。

1 淫羊藿多糖的提取、分離、純化

1.1 淫羊藿多糖的提取

1.1.1 水提法水提法是以水作為溶劑進行提取,是一種傳統的多糖提取方式,經過熱水浸煮將多糖提取出來,由于多糖不溶于乙醇,可通過醇沉將多糖提取出來。魯靜等[17]采用了均勻設計法,試驗考察因素選擇了多糖提取的料液比、提取時間、溫度、次數,以多糖得率為指標,對淫羊藿多糖熱水浸提工藝進行優化。另外在傳統水提醇沉淫羊藿多糖的基礎上,進行了Box-Benhnken中心組合試驗,采用單因素試驗,對提取時間、溫度和料液比進行了考察[18],從而優化了提取工藝,提高淫羊藿多糖的提取效率。此外,還有通過研究料水比、提取溫度、時間、次數等,采用四因素三水平正交優化試驗對該淫羊藿多糖的提取工藝進行優化[19]。水提法的試驗成本相對低廉,工藝流程簡單,比較適用于工業生產,但工序時間長,耗醇量大,且提取率相對較低。

1.1.2 微波輔助提取法微波輔助提取法是利用微波進行物質萃取,在微波反應器中使用適合的溶劑來提取各種所需的化學成分。孫永杰等[21]通過單因素實驗確定了淫羊藿多糖的提取最佳工藝條件,研究表明,在微波法對淫羊藿多糖提取含量的3個影響因素中,影響從大到小分別是微波功率、提取時間、提取料液比。另一種是在試驗中以提取物的含糖量為考察指標[22],通過單因素及正交試驗來對比研究水浴及微波輔助提取淫羊藿多糖的最佳工藝。微波輔助提取法能夠提高反應速度,具有更高的選擇性,同時能夠保持多糖原有的生物活性和功能特性,獲得具有更高黏度和溶解度的多糖,獲得具有更優越構型變化的多糖。相對于傳統的多糖提取技術,微波輔助提取法具有選擇性好、提取速度快、產品質量好等優點。

1.1.3 酶提取法酶提取法是指用酶來輔助提取多糖,酶可以加速樣品中多糖成分的釋放和提取,從而提高多糖的提取率。王超[23]使用纖維素酶水解對于淫羊藿多糖進行提取,采用了單因素實驗和正交試驗,對其提取工藝進行優化。采用纖維素酶輔助熱水浸提法從淫羊藿中提取淫羊藿多糖[24],進行了單因素試驗與響應面設計來進行分析酶濃度、溫度、時間3個因素對淫羊藿多糖含量的影響。經試驗表明,對于多糖含量影響最大的為酶提溫度。與傳統的多糖提取方法相比,酶提取法的優點主要為反應速率快、雜質易除、得率高等。

1.1.4 超聲波輔助提取法超聲波輔助提取法是利用超聲波來促使提取劑向同液界面擴散,能夠使原料與溶劑混合更加均勻,從而提高多糖的得率。孫永杰等[21]使用乙醇與蒸餾水作為提取劑,進行了單因素試驗,考察因素選取淫羊藿多糖的提取時間、提取溫度、提取料液比,再進行正交試驗法優化提取淫羊藿多糖結果。潘佳[25]采用超聲波水提法來進行提取淫羊藿葉多糖,并利用了正交試驗法優化了淫羊藿多糖的提取條件。試驗利用超聲技術從干的淫羊藿葉中提取淫羊藿多糖[26],在超聲輔助下,采用了響應面法分析了3個原因對該物質提取程度的影響,影響成都從大到小超聲功率、溫度、超聲時間。超聲波輔助提取法是一種高效實用的多糖提取方法,能夠降低反應溫度,提高反應速度,且能使提取具有選擇性,與傳統的多糖提取法比,提取效率較高且耗能較低。表1對于淫羊藿多糖提取方法里的工藝、得率及提取效果進行總結。

表1 常見的淫羊藿多糖提取方法及效果

1.2 淫羊藿多糖的分離純化淫羊藿多糖的粗提取物中含有多種成分,提取淫羊藿多糖之后要除去其中的蛋白質、雜質、色素等其他物質,從而獲得純度較高的淫羊藿多糖。

1.2.1 淫羊藿多糖的脫蛋白多糖脫蛋白主要使用酶法、Sevage法、氯化鈣法、鹽酸法等方法。鄭曉翠等[27]對比了Sevage法、氯化鈣法、鹽酸法等方法,得知Sevage法蛋白脫出率最高,脫出率為68.71%,且多糖損失率僅為21.25%。雖然Sevage法蛋白的脫出率較高,且糖損失率最低,但該法所用試劑氯仿具有毒性。張曜武等[28]采用木瓜蛋白酶法去除淫羊藿多糖中的蛋白質成分,通過考察了酶用量、溫度、pH及酶解時間等因素對蛋白質脫除效果的影響,得到的酶法適用工藝條件為木瓜蛋白酶液占底物料液體積的10%,溫度55 ℃,pH 6.0,酶解1 h。在此條件下,蛋白去除率可達90%,多糖的損失率為16%。

1.2.2 淫羊藿多糖的脫色常用的多糖脫色方法主要有活性炭、H2O2、樹脂、Al2O3柱層析、聚酰胺、殼聚糖脫色等[29]。

羅小燕[30]在單因素研究基礎上,設置脫色率為指標,選擇正交設計試驗進行篩選,最優脫色工藝為ads-7大孔樹脂進行動態吸附180 min、淫羊藿多糖供試液設置上樣濃度0.33 g·mL-1、上樣量等于1.5倍柱體積,流速保持1 mL·min-1,過濾完成后收集濾液,測定多糖脫色率為63.59%。

1.2.3 淫羊藿多糖的純化多糖純化主要使用色譜法,包括離子交換和凝膠色譜等方法[31]。試驗[25]中通過熱水浸提法得來的淫羊藿粗多糖經DEAF-Sepharose fast flow陰離子交換柱和Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱進行分離純化,得到了純度為82.03%的均一多糖的組分,采用高效凝膠滲透色譜法測定其分子量為31.2 kDa。

2 淫羊藿的多糖分析

多糖能夠在生物體內大量存在,屬于如同蛋白質的大分子物質,多糖也具有一、二、三、四級結構。由于單糖的種類、連接位置等都比氨基酸的多,還存在端基異構現象,所以多糖的測定比氨基酸更復雜[32]。也正是因為多糖結構具備的多樣性和復雜性導致其功能多樣性。

通過水提醇沉得到的淫羊藿粗多糖,通過DEAE-52纖維素柱及Sephadex G-100分離純化得到淫羊藿中性多糖EPS-1-1和淫羊藿酸性多糖EPS-2-1[12],采用高效凝膠色譜法、完全酸水解等方法對兩種多糖進行結構解析。在試驗[33]中將淫羊藿粗多糖分成極性、帶電荷量和相對分子量差異化的三個純化多糖片段:EAP-40-1、EAP-60-1和EAP-80-2。張寧[37]通過試驗進行提取純化,提取到淫羊藿粗多糖(EFPC)和純化淫羊藿中性多糖(EFPN)以及通過Sepharose CL-6B凝膠層析分析柱進行進一步純化的淫羊藿中性多糖(EFPN-1)。李波等[39]對提取到的朝鮮淫羊藿多糖(EFPC)進行分離純化,純化后有中性多糖(EFPN)和酸性多糖(EFPA),并進行進一步的多糖結構分析。康亦姜[40]使用了纖維素(DEAE-52)柱和葡聚糖凝膠(Sephadex G-150)柱完成淫羊藿多糖分離純化,并分析研究其主要成分。

表2為對已知多糖結構分析的來源、純化方法、分子量、單糖組成等進行總結。

表2 已知的淫羊藿多糖的組成

3 淫羊藿多糖的生物活性

3.1 抗氧化在實驗[41]中發現,50%乙醇沉淀獲得的淫羊藿多糖對于清除DPPH與ABTS自由基有較好的作用,其IC50值分別為0.42 mg·mL-1和0.54 mg·mL-1,使用200～800 mg·(kg·d)-1范圍的淫羊藿多糖進行處理,實驗結果表明,當濃度增加,淫羊藿多糖對于DPPH的自由基的清除率也在增加。由此得知淫羊藿多糖可以提升機體清除自由基的效率,降低脂質過氧化的發生。張寧[37]從金屬離子螯合、清除以及抑制自由基還有還原能力等對比研究朝鮮淫羊藿中性多糖(EFPN),使用Sepharose CL-6B凝膠層析分析柱繼續純化所獲得的朝鮮淫羊藿中性多糖(即為EFPN-1)。實驗結果表明EFPN、EFPN-1能夠在0～8 mg·mL-1范圍內有效清除羥基自由基,還發現EFPN-1清除率高達90.05%,超過了EFPN。在DPPH法中,EFPN、EFPN-1在0.05～0.4 mg·mL-1濃度范圍內有著良好的清除作用,EFPN-1清除率達到了76.68%。抗氧化實驗表明,經純化過后的朝鮮淫羊藿中性多糖EFPN-1具有較強的抗氧化能力。通過向小鼠腹腔注射大劑量的D-半乳糖構建衰老模型[10],與空白組相比,給藥10、100、200 mg·kg-1的淫羊藿多糖組顯著提高了小鼠血清和肝臟中超氧化物歧化酶、過氧化氫、還原性谷胱甘肽、谷胱甘肽過氧化物和谷胱甘肽-S-轉移酶活力,顯著減少了MDA含量,表明朝鮮淫羊藿多糖可以發揮良好的體內抗氧化作用。

3.2 免疫增強樹突狀細胞是目前發現的功能最強的抗原呈遞細胞,其可以提供信號用來進行免疫應答,從而激活T細胞[42]。楊艷君等[12]采用流式細胞術檢測淫羊藿中性多糖EPS-1-1與淫羊藿酸性多糖EPS-2-1,發現二者能夠促進骨髓來源的小鼠樹突狀細胞中的CD86、CD80、CD40以及抗原遞呈分子MHC-Ⅱ的表達,從而促進骨髓來源的小鼠樹突狀細胞的成熟,激活細胞的免疫應答,發揮免疫調節作用。

通過研究淫羊藿多糖對雞外周血淋巴細胞增殖及細胞因子分泌的影響[14],結果表明,在1.221～19.53 μg·mL-1濃度條件下,淫羊藿多糖可以單獨或協同PHA顯著推動淋巴細胞增殖以及淋巴細胞分泌細胞因子,提高細胞免疫。

3.3 抗病毒通過實驗[43]研究發現,淫羊藿多糖經硫酸化修飾后,對雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)進行雞胚成纖維細胞(CEF)感染期間具備一定抵抗感染作用。呂岫華等[44]采用免疫酶的方法進行試驗,實驗結果表明,在0.78～12.5 μg·mL-1劑量范圍的淫羊藿多糖對人類皰疹病毒早期抗原激活均有抑制作用。在小鼠實驗[45]中,研究淫羊藿多糖是否能夠對甲型H1N1流感病毒裂解疫苗存在免疫佐劑效應,結果表明,小鼠對H1N1的免疫應答在淫羊藿多糖的作用下有一定程度的增強。

綜合相關文獻所述,可以得知淫羊藿多糖具有一定程度的抗病毒作用,但相關文獻的發表時間較早,近幾年來對于淫羊藿多糖的抗病毒作用的相關研究較少,具體相關實驗仍需進一步研究。

3.4 抗衰老在實驗[10]中向小鼠腹腔內注射大劑量的D-Gal來建立衰老模型,分別使用10、100、200 mg·kg-1劑量的淫羊藿多糖進行實驗,與空白組相比較,衰老模型小組里的小鼠記憶力都明顯下降,集中表現為小鼠的潛伏期縮短且錯誤的次數增多。與衰老模型組比,給藥組均顯著增加了小鼠潛伏期,通過大量避暗實驗與跳臺實驗,小鼠的錯誤次數在顯著地減少。由此可見,淫羊藿多糖具有一定程度的抗衰老作用,但目前實驗只停留在小鼠實驗中,尚未進行人體實驗。

3.5 降血糖糖尿病屬于一種代謝疾病,其主要特征是高血糖。并且最近一段時間的發病率持續增加,但是以西藥為主的治療手段具備一定程度的副作用,這導致人們開始關注天然活性物質。其中多糖具備安全、低毒以及多種生物活性等特點,尤其是降血糖活性作為多糖重要活性之一,極具開發潛力[46]。

喬春雷[41]研究發現,乙醇體積分數為50% (EbLPⅡ)的淫羊藿多糖對于α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用,IC50值分別為24.0 mg·mL-1和1.1×10-1mg·mL-1。用不同劑量的EbLP Ⅱ對糖尿病模型小鼠進行21 d的治療實驗,得到的結果為EbLP Ⅱ灌胃組模型小鼠的空腹血糖值(FBG)和糖化血清蛋白含量(GSP)快速下降(P<0.05),基本維持在正常水平。

綜上可知,淫羊藿多糖具有較好的降血糖活性,在緩解糖尿病并發癥、調節糖尿病患者的血糖水平方面的效果較為顯著。

3.6 促進DNA合成楊娟[47]使用通過水酶法提取的淫羊藿多糖進行實驗,通過凝膠電泳實驗發現,淫羊藿多糖對于由氧化應激引起的DNA損傷具有一定的保護作用。

由于羥基脲導致“陽虛”的小鼠,在淫羊藿多糖的作用下,劉福春等[48]進行實驗研究其骨髓細胞增殖率與DNA合成率,在實驗中,使用100 μg淫羊藿多糖對1×106個細胞處理后,骨髓細胞的增殖率增加了72%,DNA合成率提高了88%。

3.7 對肝臟的保護潘佳[25]通過研究發現,400 μg·mL-1劑量組的淫羊藿多糖(EFPS)可以較為顯著的提升ADH的活性,可以降低乙醇在肝細胞中的積累,在改善酒精性脂肪肝方面具有較好的功效。趙金椽等[49]通過對寒凝血瘀的雄性SD大鼠來進行實驗研究來探討淫羊藿多糖對于肝臟基因表達的影響,實驗結果表示,與模型組相比,EFPS組的肝臟基因表達變化表現為免疫回調、激素調控和基因表達調控發生改變,確定其具有一定程度的肝臟保護作用。

3.7 其他張樂等[50]通過實驗研究觀察淫羊藿多糖(EPS)對再生障礙性貧血(AA)小鼠骨髓造血功能的作用,與模型組相比,以100 mg·kg-1EPS灌胃的EPS組的小鼠的外周血Hb水平及RBC、WBC、PLT數均明顯升高(P<0.05),由此得出結論:EPS能夠促進AA小鼠骨髓造血功能恢復。

慢性苯(BZ)暴露會導致進行性骨髓衰竭(BMF),通過小鼠實驗發現,使用淫羊藿多糖治療可以通過增加CD3+、CD4+T細胞計數和CD4+/CD8+的比率來改善T細胞介導的免疫抑制[51]。

4 構效關系

多糖結構能夠決定功能以及其生物活性。分子量能夠直接影響淫羊藿多糖生物活性,分子量存在差異的淫羊藿多糖,其抗氧化活性也不相同,通過酒精梯度分級、層析法等將淫羊藿多糖分成了3個片段EAP-40-1、EAP-60-1、EAP-80-2[12],3種片段的相對分子量分別為138、114、65 kD,根據試驗,雖然3種多糖片段均具有一定的抗氧化能力,但其中EAP-40-1具有最高的DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力和鐵離子還原能力,而EAP-60-1的ABTS自由基能力清除能力、抑制紅細胞溶血以及膜脂過氧化能力明顯超過另兩種。EAP-80-2抗氧化能力較低,且沒有明顯的抑制膜脂過氧化能力。

此外,不同官能團的引入可改變多糖的生物活性。據研究顯示,對硫酸酯化修飾的淫羊藿多糖(EPS)展開紅外光譜分析發現[52],EPS和硫酸酯化淫羊藿多糖(sulfated EPS,sEPS)都存在著多糖母體特征吸收峰,EPS之前的抗病毒活性比較低,在進行硫酸酯化后其活性得到明顯的提升,且sEPS能夠有效地減少病毒對細胞吸附作用,導致病毒的釋放受到影響,從而產生了抗病毒效應,還能夠直接的殺滅病毒。

多糖的空間構象對其活性也有著影響。經水提醇沉得到的淫羊藿粗多糖(EFPC),經過純化和進一步純化后得到朝鮮淫羊藿中性多糖(EFPN)與朝鮮淫羊藿中性多糖(EFPN-1)[36]。通過甲基化分析等分析方法,研究出EFPN-1結構是將(1→4)-α-Glcp和(1→4,6)-α-Glcp當作結構的主鏈,(1→3,6)-α-Galp當作該結構的分支,末端殘基是Ara、Gal、Rha的均一性雜多糖。在0～8 mg·mL-1范圍可以有效清除羥基自由基,清除比例高達90.05%。在0.05～0.4 mg·mL-1濃度內的EFPN、EFPN-1能夠有效地清除DPPH,EFPN-1清除率比例可以提升到76.68%。EFPN、EFPN-1在FRAP法中FRAP值分別可以達到4.40、7.04 mmol FeSO4/g。由此得知由于其鏈構象不同,相較于EPFN,EFPN-1具有更強的抗氧化能力。

5 展望

淫羊藿多糖具有提高抗氧化、抗病毒、抗衰老、降血糖的能力,能促進DNA的合成、肝臟干細胞的增殖、血小板的凝集。

展望淫羊藿多糖的進一步研究進展,主要從以下方面入手:①淫羊藿多糖具有降血糖、抗衰老、抗病毒等功能,但現階段的實驗基本都是圍繞對小鼠、大鼠、雞等動物的醫學實驗,應加快其對于人體的醫學作用方面的研究;②應加強對于淫羊藿多糖結構方面的研究,如其單糖分析、結構與其生物活性之間的關系等方面的研究;③淫羊藿多糖是中藥材淫羊藿的主要組成部分,但相比于淫羊藿的其他成分淫羊藿苷與黃酮類等,淫羊藿多糖的研究尚不夠深入,而且淫羊藿多糖有著多種較優的生物活性,應對淫羊藿多糖的研究投入更多的精力;④進行多次準確實驗,優化淫羊藿多糖提取分離純化等制備步驟,尋找適合淫羊藿多糖工廠化生產制備的生產工藝技術;⑤對淫羊藿多糖分子進行改性、修飾,以強化其已知的生物活性。