沙棘籽油軟膠囊中4種生育酚的含量測定

董蓬,王小兵,李啟艷,吳曉云,于海英,謝強勝,郭東曉

(山東省食品藥品檢驗研究院,國家藥品監督管理局化妝品原料質量控制重點實驗室,特色植物資源化妝品濟南市工程研究中心,山東 濟南 250101)

沙棘為胡頹子科沙棘屬植物Hippophae[1-3]的干燥成熟果實?！吨袊幍洹肥蛰d的沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)又名醋柳(山西)、黃酸刺、酸刺柳(陜西)、黑刺(青海)、酸刺(內蒙古),主產于內蒙古、河北、山西、陜西、甘肅、寧夏等省[4-5],是原國家醫藥局和原衛生部聯合公布的藥食同源植物。沙棘的籽、果皮、果實及果渣中都有一定量的油脂,成熟的沙棘籽中含有8%～20%的油脂,研究發現沙棘籽油中含有維生素E、類胡蘿卜素、不飽和脂肪酸等人體必需的多種營養成分,有輔助降血脂、保肝、抗氧化、醒脾健胃等多種作用,在醫藥及保健食品領域有廣闊的應用前景[6-9]。

維生素E即生育酚,是人體必需的脂溶性維生素,也是良好的抗氧化劑和營養劑,在水果、蔬菜、堅果及糧食等食物中廣泛存在。天然維生素E主要有4種,即α、β、γ和δ-生育酚,其中α-生育酚活性最強。生育酚具有多種生物活性,包括抗癌、抗衰老、抗動脈硬化、護肝、預防白內障、延緩早老性癡呆、治療胃潰瘍、調節血壓等[10-11]。

目前,已批準的沙棘籽油單方保健食品(沙棘籽油系以沙棘籽為原料經壓榨、浸出、超臨界CO2萃取等方法提取獲得)主要劑型為軟膠囊,均采用企業自擬標準,各企業對其產品中生育酚類成分的在檢驗方法、指標成分數量、含量限度等質量控制方面存在較大差異,這也導致各企業產品質量差異較大。為了更好地控制產品質量,我們建立了沙棘籽油軟膠囊中4種主要生育酚類成分的含量測定方法。

1 儀器和試劑、試藥

1.1 儀器Waters2695e高效液相色譜儀(美國Waters公司);Mettler Toledo電子天平(瑞士梅特勒-托利多集團);KQ-500E型醫用超聲洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑、試藥甲醇為色譜純,購自天津康科德科技有限公司;其他試劑均為分析純。α-生育酚購自Sigma公司,批號:LRAB6618;β-生育酚對照品購自北京曼哈格生物科技有限公司,批號:20139-810;γ-生育酚購自Sigma公司,批號:LRAB6868;δ-生育酚購自Sigma公司,批號:LRAB6868。3批樣品購自河北神興沙棘研究所,批號分別為20171104、20171105、20171106(規格均為0.65 g/粒);2批樣品購自內蒙古宇航人高技術產業有限責任公司,批號分別為20171101、20180120(規格均為0.5 mL/粒)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件色譜柱為Agilent Poroshell 120 PFP柱(4.6 mm×250 mm,4 μm);流動相為甲醇-水(94∶6);檢測波長為294 nm;柱溫為26 ℃;流速為0.9 mL·min-1;進樣量為10 μL。

2.2 對照品溶液的制備分別取α、β、γ和δ-生育酚適量,精密稱定,加無水乙醇制成每l mL含1.00 mg的單標溶液,作為儲備溶液。分別精密量取5.0 mL,置同一50 mL量瓶中,用甲醇定容至刻度,4種生育酚濃度約為100 μg·mL-1,作為混合標準溶液中間液。分別精密量取0.2、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL于10 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容至刻度,作為標準系列溶液。同時對對照品溶液進行含量標定。

2.3 供試品溶液的制備[12]皂化:取本品0.5 g,精密稱定,置150 mL平底燒瓶中,加入1.0 g抗壞血酸和0.1 g二丁基羥基甲苯(BHT),混勻,加入30 mL無水乙醇,加入20 mL氫氧化鉀溶液(50 g/100 g),沸水浴中回流皂化30 min,皂化后立即用冷水冷卻至室溫。

提取:將皂化液用30 mL水轉移至250 mL的分液漏斗中,加入50 mL石油醚(60～90 ℃)-乙醚混合液(體積比1∶1),振蕩萃取5 min,將下層溶液轉移至另一250 mL的分液漏斗中,加入50 mL的混合醚液再次萃取,合并醚層。

洗滌:用約100 mL水洗滌醚層,重復3次,直至將醚層洗至中性,去除下層水相。

濃縮:經洗滌后的醚層經無水硫酸鈉(約3 g)濾入250 mL旋轉蒸發瓶中,用約15 mL石油醚(60～90 ℃)沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉2次,并入蒸發瓶中,并將其接在旋轉蒸發儀上,于40 ℃水浴中減壓蒸餾,待瓶中醚液剩下約2 mL時,取下蒸發瓶,立即用氮氣吹至近干。用甲醇分次將蒸發瓶中殘留物溶解并轉移至10 mL容量瓶中,定容至刻度,濾過,供HPLC測定。

除不加樣品外,其余同供試品溶液制備方法制得陰性對照樣品溶液,結果見圖1。

1.δ-生育酚;2.β-生育酚;3.γ-生育酚;4.α-生育酚圖1 HPLC色譜圖

2.4 線性取標準系列溶液,按上述色譜條件,注入液相色譜儀,測得峰面積。以峰面積為縱坐標,對照品濃度為橫坐標,繪制標準曲線,計算回歸方程,結果見表1。

表1 線性關系考察

2.5 精密度試驗取同一混合對照品溶液,每次進樣10 μL,連續進樣6次,測定4種生育酚的(A)峰面積值,結果RSD在1.15%～1.67%之間,表明精密度良好。

2.6 穩定性試驗取同一混合對照品溶液,在0、2、4、6、12、24 h分別進樣10 μL,測定4種生育酚的(A)峰面積值,結果RSD在1.07%～1.78%之間,表明在24 h內穩定。

2.7 重復性試驗取批號為20171104的供試品,按照“2.3”項下方法制備供試品溶液6份,α、β、γ和δ-生育酚平均含量分別為91.1、16.3、65.9、8.5 mg/100 g,4種成分含量測定值(n=6)RSD在0.85%～1.56%之間。

2.8 回收率試驗精密稱取批號為20171104(α、β、γ和δ-生育酚含量分別為91.1、16.3、65.9、8.5 mg/100 g)的供試品6份,每份約0.25g,精密加入4種生育酚的混合對照品溶液(α、β、γ和δ-生育酚濃度分別為0.228 7、0.046 6、0.183 7、0.022 2 mg·mL-1)1 mL,置同一150 mL平底燒瓶中,按“2.3”項下方法制備供試品溶液,照“2.1”項下色譜條件測定,計算回收率,結果見表2～5。

表2 α-生育酚加標回收試驗

表4 γ-生育酚加標回收試驗數據

表5 δ-生育酚加標回收試驗數據

2.9 樣品測定取樣品,按上述方法進行處理,測定含量,結果見表6。

3 討論

在生育酚含量測定樣品處理過程中,考察了皂化時間的影響,分別考察了皂化10、20、30、40 min,結果皂化10、20 min所測含量偏低,而30、40 min所測含量基本一致,為提高效率,選擇皂化30 min。在固定檢測波長294 nm的情況下,采用乙腈-水和甲醇-水及不同的比例試驗,最后確定以甲醇-水(94∶6)為流動相,4種生育酚的分離效果最好。

沙棘籽油中營養成分復雜,為全面反映產品質量,應加強各類成分的質量控制方法開發,推動制定相關質量標準,從而保障其安全性、有效性和質量可控性。本文建立了沙棘籽油軟膠囊中4種主要生育酚的含量測定方法,該方法重復性好、專屬性強,為其質量控制提供了技術支持。