改進(jìn)的QuEChERS方法結(jié)合在線(xiàn)凝膠色譜-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定植物油中74種農(nóng)藥殘留

李潔 王艷麗 李芳芳 田其燕 鞠香 劉艷明

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（肉及肉制品監(jiān)管技術(shù)），山東省特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，產(chǎn)業(yè)技術(shù)基礎(chǔ)公共服務(wù)平臺(tái)，濟(jì)南 250101）

植物油是人們?nèi)粘Ｉ钪凶罨镜纳钯Y料之一，也是食品加工行業(yè)和烹飪行業(yè)的重要原料[1]。油料作物在種植過(guò)程中通常會(huì)使用除草劑、殺蟲(chóng)劑和殺菌劑等一系列農(nóng)藥，其果實(shí)中殘存的農(nóng)藥可能會(huì)轉(zhuǎn)移至植物油中，使植物油存在農(nóng)藥殘留的風(fēng)險(xiǎn)，危害食用者的身體健康[2-3]。近年來(lái)，消費(fèi)者對(duì)食品安全及農(nóng)藥殘留檢測(cè)的關(guān)注度日益提高，國(guó)際食品法典委員會(huì)（CAC）、日本和美國(guó)分別規(guī)定了食用油及毛油中45 種、34 種和75 種農(nóng)藥的最大殘留限量（MRL）標(biāo)準(zhǔn)[4-6]，MRL 范圍分別為0.01～200、0.01～80 和0.01～500 mg/kg。我國(guó)國(guó)標(biāo)GB 2763-2021[7]規(guī)定了植物油中88 種農(nóng)藥的MRL，限量范圍為0.01～1 mg/kg。隨著植物油產(chǎn)業(yè)進(jìn)出口貿(mào)易量日益增多，對(duì)植物油中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)技術(shù)也提出了更高的要求。與蔬菜和水果等普通的植物源性食品不同，植物油成分復(fù)雜，主要包括脂肪、甾醇及甾醇酯、磷脂、色素和游離脂肪酸等，在提取殘留農(nóng)藥的過(guò)程中，這些化合物容易被共萃取出來(lái)，如果凈化不徹底，檢測(cè)時(shí)易產(chǎn)生嚴(yán)重的基質(zhì)干擾，假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)頻率增大[8-9]；另外，脂肪等基質(zhì)容易沉積在離子源表面，抑制目標(biāo)物的離子化，降低儀器的靈敏度，也會(huì)對(duì)色譜柱產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的損壞，因此，選擇合適的前處理凈化技術(shù)尤為關(guān)鍵。

近年報(bào)道的凈化技術(shù)有冷凍除脂[10-12]、QuEChERS[13-15]、固相萃取（SPE）[16-17]、分散固相萃取[18]、基質(zhì)固相分散萃取[19]、固相微萃取[20]、帶磁性的納米粒子或分子印跡聚合物的應(yīng)用[17-18，21-22]、液液微萃取[23-24]、液液萃取[25]及凝膠色譜（GPC）凈化[26-27]等。其中，冷凍除脂時(shí)間較長(zhǎng)（2～14 h），檢測(cè)效率低；干冰冷凍除脂時(shí)間為5 min，時(shí)間不易控制，如果時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，目標(biāo)物易與脂肪共同沉淀，降低回收率[11]。目前，SPE 凈化方法較為成熟，利用EMR-lipd 除脂專(zhuān)用柱進(jìn)行除脂，除脂效果良好，但操作繁瑣、成本較高。QuEChERS 方法操作簡(jiǎn)便、快速，但對(duì)于植物油這類(lèi)基質(zhì)復(fù)雜的樣品，只能去除部分雜質(zhì)，基質(zhì)干擾物所導(dǎo)致的基質(zhì)效應(yīng)問(wèn)題依然存在。GPC 是一種基于相對(duì)分子質(zhì)量的大小對(duì)化合物進(jìn)行分離的高效分析凈化技術(shù)，David 等[28]的研究表明，GPC 可有效去除動(dòng)物油脂和植物油脂中的脂肪、色素和甾醇等雜質(zhì)。現(xiàn)有GPC 餾分接收時(shí)間的確定均采用滅螨猛和氟胺氰菊酯這2 種農(nóng)藥殘留進(jìn)行定位，不能對(duì)不同的食品基質(zhì)進(jìn)行針對(duì)性的雜質(zhì)去除，也無(wú)法保證目標(biāo)物的回收率。

綜合考慮我國(guó)和其它國(guó)家及組織限量規(guī)定的農(nóng)藥種類(lèi)及化合物的性質(zhì)等因素，本研究選擇適用于氣相色譜檢測(cè)技術(shù)的74 種農(nóng)藥作為目標(biāo)物，植物油樣品采用正己烷飽和的乙腈提取、乙腈飽和的正己烷除脂，采用改進(jìn)的QuEChERS 方法凈化，在線(xiàn)凝膠色譜-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（On-line GPC-GC-MS/MS）檢測(cè)，建立了一種同時(shí)檢測(cè)植物油中74 種農(nóng)藥殘留的方法。本研究結(jié)合QuEChERS 與On-line GPC 凈化兩種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了單一凈化方式凈化能力差的缺點(diǎn)，提出了QuEChERS 與在線(xiàn)GPC 凈化效果的評(píng)價(jià)方法，建立了植物油中多農(nóng)藥殘留的同時(shí)快速和準(zhǔn)確檢測(cè)的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TQ8040 凝膠色譜-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（日本Shimadzu 公司）；3-18K 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma 公司）。敵敵畏、滅線(xiàn)磷、氟樂(lè)靈、久效磷、樂(lè)果、甲拌磷、α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、特丁硫磷、地蟲(chóng)硫磷、二嗪磷、嘧霉胺、氯唑磷、甲基毒死蜱、七氯、甲霜靈、甲基嘧啶磷、殺螟硫磷、馬拉硫磷、甲拌磷砜、毒死蜱、倍硫磷、對(duì)硫磷、三唑酮、三氯殺螨醇、噻唑磷、甲基異柳磷、二甲戊靈、氟蟲(chóng)腈、硫環(huán)磷、腐霉利、三唑醇、殺撲磷、反-氯丹、順-氯丹、丁草胺、α-硫丹、β-硫丹、丙溴磷、狄氏劑、腈菌唑、氟硅唑、噻嗪酮、三唑磷、丙環(huán)唑、戊唑醇、炔螨特、苯酰菌胺、亞胺硫磷、聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、伏殺硫磷、氯氟氰菊酯、聯(lián)苯三唑醇、氯菊酯、噠螨靈、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、氟氰戊菊酯、氰戊菊酯、苯醚甲環(huán)唑、溴氰菊酯、嘧菌酯、甲草胺、p,p-滴滴滴、p,p-滴滴伊、o,p-滴滴涕、p,p-滴滴涕、乙草胺、醚菌酯、聯(lián)苯肼酯和吡唑嘧菌酯（用量均為1 mL，濃度為1000 mg/L）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購(gòu)自北京振翔有限公司；乙腈、丙酮、正己烷和環(huán)己烷（色譜純，德國(guó)Merck 公司）；N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18）填料（色譜純，美國(guó)Agilent 公司）；MgSO4（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。橄欖油、花生油、大豆油和芝麻油購(gòu)自當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 儀器條件

1.2.1 凝膠色譜條件

色譜柱為Shodex EV-200（150 mm×2 mm），柱溫箱40 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流動(dòng)相為丙酮-環(huán)己烷（3∶7，V/V），流速為0.1 mL/min。

1.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜條件

采用程序升溫-大體積進(jìn)樣口（PTV-LVI）升溫程序：起始溫度為120 ℃，保持5.0 min，再以100 ℃/min升溫至280 ℃，保持33.4 min；不分流進(jìn)樣；柱流量1.75 mL/min。色譜柱：預(yù)柱為DB-5MS 石英毛細(xì)管柱（5 m×0.25 mm×0.25 μm，美國(guó)Agilent 公司），分析柱為DB-5MS（25 m×0.25 mm×0.25 μm，美國(guó)Agilent 公司）。色譜柱升溫程序：起始溫度為82 ℃，保持5 min，以8 ℃/min 速率程序升溫至300 ℃，保持7.75 min。載氣為氦氣。電子轟擊源（EI）：70 eV；離子源溫度：200 ℃；輔助加熱溫度：300 ℃；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確移取0.1 mL 濃度為1000 mg/L 的各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品及儲(chǔ)備溶液至同一個(gè)10 mL 容量瓶中，用丙酮定容，配制成74 種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度為10 mg/L。

1.4 QuEChERS樣品前處理方法

稱(chēng)取植物油樣品2.0 g，用20 mL 正己烷飽和的乙腈渦旋提取5 min，5000 r/min 離心2 min；將上清液轉(zhuǎn)入另一個(gè)離心管中，在提取液中加入10 mL 乙腈飽和的正己烷，渦旋1 min，5000 r/min 離心2 min；取乙腈層至QuEChERS 凈化管中（內(nèi)含150 mg PSA、150 mg C18和150 mg MgSO4）凈化，5000 r/min 離心2 min；取10 mL 上清液至15 mL 離心管中，氮吹近干，加入1 mL 丙酮復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm 有機(jī)相濾膜過(guò)濾后，進(jìn)行GPC-GC-MS/MS 分析。

1.5 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

樣品分析溶液在注入儀器后，由于存在共洗脫物，分析目標(biāo)物的信號(hào)可能會(huì)增強(qiáng)或減弱，進(jìn)而產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect，ME）。本研究通過(guò)測(cè)定基質(zhì)空白提取液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率的比值評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)：ME（%）=（A–B）/A×100，其中，A為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率，B為溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的確定

對(duì)74 種農(nóng)藥的母離子、子離子和碰撞能量等系列質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。首先將74 種農(nóng)藥殘留的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液導(dǎo)入氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中進(jìn)行全掃描（Full scan），對(duì)照NIST 譜庫(kù)，得到74 種農(nóng)藥的保留時(shí)間和碎片離子，選擇質(zhì)量數(shù)較大、強(qiáng)度較高的碎片離子，利用儀器軟件的Auto SRM 功能，得到離子對(duì)和碰撞能量的優(yōu)化曲線(xiàn)，選擇出最優(yōu)的離子對(duì)及碰撞電壓，詳見(jiàn)電子版文后支持信息表S1。

2.2 提取溶劑的選擇

食品中農(nóng)藥殘留檢測(cè)通常采用丙酮、乙酸乙酯、乙腈和正己烷飽和的乙腈作為提取溶劑。由于植物油與丙酮和乙酸乙酯可以互溶，因此，在提取目標(biāo)物的同時(shí)，基質(zhì)也被共提取出來(lái)，影響檢測(cè)，不適于作為提取溶劑。考察了乙腈和正己烷飽和的乙腈對(duì)74 種農(nóng)藥的提取效率，回收率結(jié)果見(jiàn)電子版文后支持信息表S2。結(jié)果表明，以正己烷飽和的乙腈為提取劑時(shí)，74 種農(nóng)藥中除樂(lè)果回收率為66.8%外，其余農(nóng)藥的回收率均在70%～110%之間，滿(mǎn)足檢測(cè)需求；乙腈作為提取劑時(shí)，三氯殺螨醇、硫環(huán)磷和二甲戊靈等17 種農(nóng)藥的回收率低于70%，而對(duì)硫磷和氯氰菊酯的回收率僅為53.4%和57.6%，無(wú)法準(zhǔn)確定量分析。推測(cè)正己烷飽和的乙腈提取效率較高的原因可能是其基于相似相溶原理，能夠?qū)⒅苄缘霓r(nóng)藥高效地萃取出來(lái)。

2.3 除脂條件的優(yōu)化

2.3.1 除脂方式的選擇

植物油中主要成分為脂肪，在提取農(nóng)藥殘留的過(guò)程中，為了提高非極性和弱極性等脂溶性農(nóng)藥的回收率，選用正己烷飽和的乙腈作為提取溶劑，這也使得共提取的脂肪含量較高，需要對(duì)提取液進(jìn)行除脂處理。分別采用乙腈飽和的正己烷萃取、–20 ℃冷凍及–78 ℃冷凍3 種方式進(jìn)行除脂，根據(jù)文獻(xiàn)[10-11]，選取–20 ℃和–78 ℃時(shí)的冷凍時(shí)間分別為12 h 和5 min。比較了3 種方式去除脂肪的效果（見(jiàn)電子版文后支持信息圖S1），結(jié)果表明，正己烷去除脂肪的量最多，為27.1 mg，兩種冷凍除脂方式的去脂肪質(zhì)量分別為7.4 mg（–78 ℃冷凍）和18.9 mg（–20 ℃冷凍）。

將按3 種方式除脂后的溶液在GC-MS 上進(jìn)行全掃描，色譜圖見(jiàn)圖1。正己烷萃取除脂后，色譜圖上的峰個(gè)數(shù)及峰的響應(yīng)明顯低于兩種冷凍除脂方式，在15.5～18.0 min 及32.0～34.0 min 時(shí)間范圍內(nèi)，乙腈飽和的正己烷除脂后，色譜峰更干凈。尤其32.75 min 處的色譜峰，采用正己烷萃取方式除脂時(shí)的峰面積為19230.6，而采用兩種冷凍方式除脂時(shí)峰面積分別是13339378（–20 ℃）和13319154（–78 ℃），經(jīng)NIST 譜庫(kù)檢索此峰可能為三十碳六烯。由于正己烷和三十碳六烯均為烴類(lèi)化合物，極性相似，進(jìn)一步驗(yàn)證了正己烷的去脂效果，因此選取正己烷去除脂肪。

2.3.2 正己烷用量的優(yōu)化

對(duì)于脂溶性強(qiáng)的農(nóng)藥，除脂時(shí)正己烷的用量對(duì)其回收率有很大的影響。在空白基質(zhì)油脂中加入20 μg/kg 的74 種農(nóng)藥，考察了正己烷的用量（2、5、10 和20 mL）對(duì)目標(biāo)物的回收率和脂肪的去除率的影響。結(jié)果表明，正己烷用量越大，雜質(zhì)峰的干擾越少，說(shuō)明脂肪的去除率越大；正己烷的用量對(duì)大部分化合物的回收率影響不大，但是對(duì)于硫丹、氯丹和七氯等14 種化合物，隨著正己烷的用量增加，回收率逐漸降低。如圖2A 所示，正己烷用量為2 mL 時(shí)，14 種化合物的回收率在78.6%～105.2%之間；正己烷用量為5 和10 mL 時(shí)，目標(biāo)物的回收率相差不大，均在70%～101%之間；正己烷用量為20 mL 時(shí)，回收率均降至80%以下，三氯殺螨醇、α-硫丹、β-硫丹、p,p′-DDE 和o,p′-DDT 的回收率甚至低于60%，不能準(zhǔn)確定量分析，這可能是由于這幾種化合物極性較弱，在正己烷中的溶解性?xún)?yōu)于乙腈，隨著正己烷用量增大，在乙腈中的殘留量減少，導(dǎo)致回收率降低。

圖2 正己烷用量的優(yōu)化：（A）正己烷用量對(duì)回收率的影響；（B）不同正己烷用量下回收率和基質(zhì)峰面積的比值a，七氯；b，三氯殺螨醇；c，反-氯丹；d，α-硫丹；e，順-氯丹；f，p,p′-滴滴伊（p,p-DDE）；g，狄氏劑；h，β-硫丹；i，p,p′-滴滴滴（p,p-DDD）；j，o,p′-滴滴涕（o,p-DDT）；k，p,p′-滴滴涕（p,p-DDT）；l，聯(lián)苯菊酯；m，氯菊酯；n，氯氰菊酯Fig.2 Optimization of n-hexane volume: (A) Effects of different volumes of n-hexane on recovery;(B) Ratio of recovery to matrix peak area at different volumes of n-hexanea,heptachlor;b,dicofol;c, β-chlordane;d, α-endosulfan;e,α-chlordane;f,1,1′-(dichlorovinylidene)bis[chlorobenzene](p,p-DDE);g,dieldrin;h, β-endosulfan;i,1,1-dichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl)ethane (p,p-DDD);j,1,1,1-trichloro-2-(2-chlorophenyl)-2-(4-chlorophenyl)ethane (o,p-DDT);k,1,1,1-trichloro-2,2-bis[4-chlorophenyl]ethane (p,p-DDT);l,diphenyl ester;m,permethrin;n,cypermethrin

上述結(jié)果表明，正己烷用量越大，基質(zhì)的去除效果越好，在色譜圖上的響應(yīng)峰面積越小，但相應(yīng)的目標(biāo)物的回收率也會(huì)降低，需要優(yōu)化正己烷的用量，以達(dá)到最優(yōu)的除脂及回收效果，因此考察了不同正己烷用量條件下的回收率與基質(zhì)峰面積的比值，此值越大，說(shuō)明回收率降低的程度越低于基質(zhì)減少的程度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也更準(zhǔn)確。如圖2B 所示，當(dāng)正己烷用量為10 mL 時(shí)，回收率/基質(zhì)峰面積的比值最大，在此條件下雜質(zhì)去除多，并可保證回收率在可接受的范圍內(nèi)。因此，本研究選擇10 mL 正己烷進(jìn)行除脂。

2.4 QuEChERS條件的優(yōu)化

正己烷可有效去除大部分非極性或弱極性的雜質(zhì)化合物，但是對(duì)于一些極性的游離脂肪酸和甾醇的去除效果不佳。PSA、C18、弗羅里硅土（Florisil）和中性氧化鋁（Al2O3）等材料常作為吸附劑[3,14-15]。本研究在空白基質(zhì)油脂中加入20 μg/kg 的74 種農(nóng)藥，分別選用PSA、C18、PSA+C18、弗羅里硅土（Florisil）和中性氧化鋁作為吸附劑，對(duì)74 種農(nóng)藥殘留的回收率進(jìn)行考察。如圖3 所示，大部分農(nóng)藥的回收率滿(mǎn)足要求，但敵敵畏、久效磷、甲拌磷和對(duì)硫磷等17 種農(nóng)藥的回收率差別較大。Florisil 和中性氧化鋁作為吸附劑時(shí)，17 種農(nóng)藥的回收率分布較分散，在22%～130%之間；敵敵畏、久效磷、三唑醇、戊唑醇、聯(lián)苯三唑醇、甲拌磷和聯(lián)苯肼酯的回收率均低于70%，尤其對(duì)于敵敵畏，兩種吸附劑的回收率均低于40%，無(wú)法準(zhǔn)確定量分析。PSA、C18和PSA+C18這3 種吸附劑的回收率均在70%～120%之間，其中，PSA+C18作為吸附劑時(shí)回收率的分布更集中，除敵敵畏的回收率為75%外，其它16 種農(nóng)藥的回收率均在90%～110%之間，并且基質(zhì)峰的干擾最少。

圖3 不同吸附劑的回收率Fig.3 Recoveries of different sorbents

由于C18材料屬于反向硅膠鍵合吸附劑，可通過(guò)疏水作用較好地吸附非極性的組分和弱極性的干擾物（如脂肪酸、氨基酸、脂肪和脂類(lèi)等）[14]。PSA 材料的硅膠表面鍵合有極性官能團(tuán)，屬于弱陰離子交換吸附劑，對(duì)樣品中的一些強(qiáng)極性雜質(zhì)、有機(jī)酸、色素、糖、脂肪酸和金屬離子等具有良好的凈化效果，使得基質(zhì)峰的干擾較少[29]。弗羅里硅土柱是硅膠鍵合氧化鎂的吸附劑，與硅膠相似，是強(qiáng)極性吸附劑，可以從非極性溶液中萃取極性化合物，在萃取雜質(zhì)的同時(shí)，一些極性目標(biāo)物也可能會(huì)被萃取出去，導(dǎo)致有機(jī)磷農(nóng)藥回收率降低。因此，選用PSA+C18作為吸附劑。

考察了不同用量的吸附劑（50、100、150、200、250 mg）對(duì)雜質(zhì)去除率的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)吸附劑的用量≥150 mg 時(shí)，基質(zhì)峰面積明顯降低，基線(xiàn)趨于平滑；當(dāng)吸附劑的用量為200 和250 mg 時(shí)，敵敵畏、久效磷和樂(lè)果等有機(jī)磷農(nóng)藥的回收率降低。因此，選擇吸附劑的最佳用量為150 mg。

2.5 凝膠色譜條件的優(yōu)化

GPC 凈化技術(shù)是一種根據(jù)分子量的大小對(duì)化合物進(jìn)行分離的技術(shù)，其關(guān)鍵是確定餾分的接收時(shí)間，以確保目標(biāo)物的有效導(dǎo)入及雜質(zhì)的高效去除。文獻(xiàn)[15]報(bào)道的GPC 餾分接收時(shí)間采用滅螨猛和氟胺氰菊酯兩種農(nóng)藥殘留的保留時(shí)間進(jìn)行確定，其缺點(diǎn)是不能對(duì)不同的食品基質(zhì)進(jìn)行針對(duì)性的雜質(zhì)去除，也無(wú)法能保證目標(biāo)物的回收率。本研究針對(duì)植物油基質(zhì)與目標(biāo)農(nóng)藥殘留在GPC 上的保留行為，創(chuàng)新性的提出導(dǎo)入效率（Import efficiency，IE）的概念。將74 種農(nóng)藥殘留的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液注入到On-line-GPC-GC-MS/MS，得到的各化合物的峰面積與未經(jīng)GPC 凈化直接注入GC-MS/MS 得到的各化合物的峰面積的比值定義為導(dǎo)入效率（IE（%）=A/B×100，其中，A為經(jīng)由GPC 凈化的標(biāo)準(zhǔn)溶液中各化合物的響應(yīng)峰面積，B為未經(jīng)GPC 凈化的標(biāo)準(zhǔn)溶液中各化合物的響應(yīng)峰面積）。通過(guò)計(jì)算導(dǎo)入效率，可精準(zhǔn)測(cè)定所有目標(biāo)化合物經(jīng)由GPC 凈化后的回收率，為餾分接收時(shí)間段的確定提供數(shù)據(jù)支持。本研究考察了不同餾分接收時(shí)間段內(nèi)目標(biāo)物的導(dǎo)入效率和基質(zhì)效應(yīng)，以獲得最優(yōu)的餾分接收時(shí)間。

2.5.1 餾分接收時(shí)間的考察

本研究選用74 種農(nóng)藥殘留中相對(duì)分子質(zhì)量最大的溴氰菊酯（505.2）和相對(duì)分子質(zhì)量最小的嘧霉胺（199.25）作為指示物，分別將溴氰菊酯（濃度為10 μg/mL）、嘧霉胺（濃度為10 μg/mL）和橄欖油空白基質(zhì)溶液注入在線(xiàn)凝膠色譜儀中，其紫外檢測(cè)光譜圖見(jiàn)圖4A。空白基質(zhì)溶液、溴氰菊酯和嘧霉胺標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間分別為2.92、3.55 和4.13 min，從光譜圖可知，收集不同時(shí)間段內(nèi)的餾分，可實(shí)現(xiàn)植物油中大分子雜質(zhì)和目標(biāo)物的有效分離。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白基質(zhì)溶液的紫外檢測(cè)光譜圖（A）和不同時(shí)間段餾分74 種農(nóng)藥殘留的導(dǎo)入效率（B）Fig.4 Ultraviolet dectetion spectra of standard solutions and blank matrix solution(A)and recovery of 74 kinds of residues in different distillates (B)

考察了收集不同時(shí)間段內(nèi)的餾分時(shí)，74 種農(nóng)藥殘留從在線(xiàn)GPC 向GC-MS/MS 儀器的導(dǎo)入效率。將濃度為0.1 μg/mL 的74 種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液注入到凝膠色譜柱中，分別收集3.00～5.55 min（全部導(dǎo)入）和3.55～5.55 min（部分導(dǎo)入）時(shí)間段內(nèi)的餾分，計(jì)算每種化合物的導(dǎo)入效率，結(jié)果見(jiàn)圖4B。全部導(dǎo)入時(shí)，74 種農(nóng)藥殘留的導(dǎo)入效率為71.3%～102.7%；部分導(dǎo)入時(shí)，僅有33 種農(nóng)藥殘留的導(dǎo)入效率在70%以上，對(duì)于溴氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、氟氰戊菊酯和氯氟氰菊酯等分子量較大的化合物，導(dǎo)入效率僅為14.0%～46.5%，較低的導(dǎo)入效率降低了方法的靈敏度，影響檢測(cè)的準(zhǔn)確度。因此，選擇3.00～5.55 min 為餾分的接收時(shí)間段。

2.5.2 不同餾分接收時(shí)間段內(nèi)目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)

由圖4A 可見(jiàn)，農(nóng)藥殘留全部導(dǎo)入時(shí)，有部分大分子雜質(zhì)隨著目標(biāo)物一同進(jìn)入了GC-MS/MS 儀器，可能會(huì)對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生影響，而部分導(dǎo)入可將90%的大分子雜質(zhì)去除。因此，本研究考察了兩種時(shí)間段流出的基質(zhì)對(duì)74 種農(nóng)藥殘留產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)，以考察共洗脫出的雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生的影響，結(jié)果見(jiàn)電子版文后支持信息表S3。當(dāng)農(nóng)藥殘留部分導(dǎo)入時(shí)，66 種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)為0.3%～19.3%，表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)；8 種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)為23.0%～48.8%，表現(xiàn)為中等強(qiáng)度基質(zhì)效應(yīng)。收集3.00～5.55 min 時(shí)間段內(nèi)餾分時(shí)，64 種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)為0.1%～19.7%，表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)；10 種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)為24.4%～48.5%，表現(xiàn)為中等強(qiáng)度基質(zhì)效應(yīng)。以上結(jié)果表明，兩種餾分收集方法均有少部分農(nóng)藥需要進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)校正，綜合考慮導(dǎo)入效率和基質(zhì)效應(yīng)，確定餾分的收集時(shí)間為3.00～5.55 min。

2.6 QuEChERS-GPC聯(lián)用技術(shù)的優(yōu)勢(shì)

利用優(yōu)化的提取溶劑和除脂方式對(duì)樣品進(jìn)行處理后，分別采用QuEChERS、On-line GPC、QuEChERS+On-line GPC 這3 種方式對(duì)樣品溶液進(jìn)行凈化，比較凈化效果，色譜圖見(jiàn)圖5。僅采用在線(xiàn)GPC 凈化的提取液，在a、b 時(shí)間段內(nèi)及31.5 min 處均有明顯的雜質(zhì)峰；只經(jīng)過(guò)QuEChERS（PSA 和C18）凈化的提取液，a、b 時(shí)間段的色譜峰比較平滑，在c 時(shí)間段內(nèi)出現(xiàn)群峰；而經(jīng)過(guò)兩者雙重凈化后，在3 個(gè)時(shí)間段內(nèi)的色譜峰強(qiáng)度均下降。通過(guò)NIST 譜庫(kù)檢索，a、b 時(shí)間段內(nèi)的雜質(zhì)峰主要為棕櫚酸和油酸，c 時(shí)間段內(nèi)的群峰為油酸甘油酯、維生素E 和β-谷甾醇。在柱容量允許的情況下，GPC 可有效去除99%的脂質(zhì)物質(zhì)[28]，因此經(jīng)GPC 凈化后，c 時(shí)間段的甘油酯類(lèi)化合物得到了有效去除。由于凝膠色譜柱僅能除去特定分子大小的化合物，不能分辨與目標(biāo)物分子大小相近的化合物，因此不能對(duì)油脂中所有雜質(zhì)成分進(jìn)行去除，而PSA 和C18對(duì)有機(jī)酸和非極性化合物有較好的吸附作用，使a、b 時(shí)間段內(nèi)的棕櫚酸和油酸也得到了有效去除。因此，QuEChERS 及On-line GPC 兩種凈化方式缺一不可。

圖5 不同凈化條件下樣品溶液的全掃描色譜圖Fig.5 Full scan chromatograms of sample solution under different purification conditions

2.7 定量方式的選擇

考察了74 種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)，如圖6 所示，74 種農(nóng)藥中有10 種農(nóng)藥|ME|≥20%，需對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行校正。植物油種類(lèi)較多，基質(zhì)較復(fù)雜，為滿(mǎn)足不同種類(lèi)植物油的分析要求，降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析。

圖6 74 種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)Fig.6 Matrix effects of 74 kinds of pesticides

2.8 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.8.1 線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)及定量限

取空白樣品處理液加入一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，得到系列濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，按濃度由低到高依次測(cè)定，以各物質(zhì)定量離子對(duì)的峰面積（Y）對(duì)其質(zhì)量濃度（X）作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)均大于0.998。采用空白基質(zhì)加標(biāo)的方法，以信噪比S/N=10 得到目標(biāo)物的定量限（LOQ），以信噪比S/N=3 得到目標(biāo)物的檢出限（LOD）。74 種農(nóng)藥的線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見(jiàn)電子版文后支持信息表S4，結(jié)果表明，相關(guān)化合物的檢出限可以滿(mǎn)足GB 2763-2021[7]和其它國(guó)家及組織對(duì)植物油中農(nóng)藥殘留的限量要求。

2.8.2 回收率和精密度

由于不同農(nóng)藥的檢出限不同，選取檢出限最高的農(nóng)藥聯(lián)苯三唑醇的LOD 作為加標(biāo)實(shí)驗(yàn)的最低水平。在橄欖油、大豆油和花生油這3 種陰性樣品基質(zhì)中，分別添加1 倍LOD、2 倍LOD 和4 倍LOD 濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，靜置2 h，待各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品被樣品充分吸收后，利用本方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度水平重復(fù)測(cè)定6 次。結(jié)果（見(jiàn)電子版文后支持信息表S5）表明，加標(biāo)水平在1～4 倍LOD 時(shí)，74 種農(nóng)藥在橄欖油中的加標(biāo)回收率為73.0%～112.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.5%～8.6%；在大豆油中的加標(biāo)回收率為84.3%～109.8%，RSD 為2.5%～7.6%；在花生油中的加標(biāo)回收率為80.5%～115.3%，RSD 為0.8%～8.1%。上述結(jié)果表明，本方法的準(zhǔn)確度和精密度均能滿(mǎn)足植物油中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求。

2.9 實(shí)際樣品的篩查

采用本方法對(duì)市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的60 批次植物油樣品進(jìn)行分析，植物油樣品涉及橄欖油、花生油、大豆油和芝麻油，有2 批次大豆油樣品和6 批次花生油樣品被檢出毒死蜱，其中，大豆油樣品的檢出值為14.8 和23.7 μg/kg，低于GB 2763-2021[7]對(duì)大豆油中毒死蜱的限量規(guī)定；花生油樣品的檢出值在18.6～116 μg/kg之間，我國(guó)GB 2763-2021[7]、CAC 和日本等均未對(duì)花生油中的毒死蜱作限量要求。

3 結(jié)論

本研究將QuEChERS 與在線(xiàn)On-line GPC 凈化技術(shù)相結(jié)合，建立了植物油中多農(nóng)藥殘留的GC-MS/MS檢測(cè)技術(shù)，解決了單一凈化方式凈化不徹底的問(wèn)題。提出了目標(biāo)物由GPC 至GC-MS/MS 的導(dǎo)入效率概念，對(duì)GPC 的餾分接收時(shí)間段進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的有效導(dǎo)入和基質(zhì)的高效去除。采用正己烷飽和的乙腈作為提取溶劑，可提高脂溶性農(nóng)藥的回收率。利用稱(chēng)重法、全掃描法及回收率與基質(zhì)峰面積比值等多種評(píng)價(jià)方式，全面考察了QuEChERS 技術(shù)的除雜效果。通過(guò)對(duì)GC-MS/MS 工作條件的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了一次進(jìn)樣同時(shí)完成植物油中74 種農(nóng)藥的檢測(cè)分析。本研究建立的QuEChERS 結(jié)合On-line-GPC-GC-MS/MS的檢測(cè)技術(shù)，可用于含油脂食品中其它農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，為含油脂食品中農(nóng)藥殘留、塑化劑和多環(huán)芳烴等一系列危害物的檢測(cè)提供了參考，提出的基質(zhì)去除方法、基質(zhì)去除效果的評(píng)價(jià)方式及GPC 條件優(yōu)化程序可為其它目標(biāo)物的檢測(cè)提供理論指導(dǎo)。

支持信息

Supporting information

表S1 74 種農(nóng)藥的保留時(shí)間、定量定性離子對(duì)及碰撞能Table S1 Retention time,monitoring ion pairs and collision energies of 74 kinds of pesticides

圖S1 三種除脂方式去除脂肪的量Fig.S1 Fat removal quality of three methods