超高壓液相色譜-串聯質譜法測定奶粉中抗吸蟲藥物殘留

楊帆 張曉梅 閻炳 楊衛海 孫靜文 李梓昱 黃玲利張鴻偉*, 徐杰*

1（中國海洋大學食品科學與工程學院，青島266520）

2（青島海關技術中心，青島 266109）

3（青島海關，青島 266002）

4（華中農業大學動物科學技術學院、動物醫學院，武漢 430070）

吸蟲病是牛和羊等食草動物嚴重的寄生蟲病之一，也是人畜共患的寄生蟲病[1]，給牲畜和人類健康帶來巨大威脅，也會對畜牧業生產造成嚴重的經濟損失[2]。在牛羊吸蟲病的防治中，氯氰碘柳胺[3]、硝碘酚腈[4]、碘醚柳胺[5]和三氯苯達唑[6]為常用廣譜驅蟲藥，對多種吸蟲病有良好療效[7]。抗吸蟲藥在我國牛羊養殖中普遍使用[8]，但在停藥期的不合理使用、動物產品生產加工不規范和環境污染等情況下[9]，容易導致該類藥物在牛羊乳中的殘留[10]。目前研究發現，多數抗吸蟲藥具有較強的細胞毒性，而奶粉是牛羊乳的主要加工制品[11]，長期食用含有抗吸蟲藥物殘留的奶粉易導致人體產生抗藥性，給消費者帶來健康隱患[12]。當前，中國（GB 31650-2019）[13]和歐盟（EU（No）37/2010）[14]針對乳品中常見抗吸蟲類藥物均制定了最大殘留限量（Maximum residue limits，MRLs），范圍在10～45 μg/kg 之間，相關藥物的化學結構和化學信息見圖1。

圖1 氯氰碘柳胺（A）、硝碘酚腈（B）、碘醚柳胺（C）、三氯苯達唑（D）和三氯苯達唑酮（E）的化學結構和理化參數Fig.1 Chemical structures and physicochemical parameters of closantel (A),nitroxinil (B),rafoxanide (C),triclabendazole (D) and ketotriclabnedazole (E)

目前，我國尚未建立涵蓋奶粉基質的抗吸蟲藥物殘留檢測方法標準，因此，建立靈敏可靠的分析方法具有現實緊迫性。相比普通液體乳，奶粉基質組成更為復雜[15]，因此測定分析時，樣品的前處理凈化步驟顯得尤為關鍵[16]。常用于抗吸蟲藥物殘留測定的前處理凈化方法有液-液萃取法[17]、固相萃取法[18]和QuEChERS 法[19]等，其中，固相萃取法和QuEChERS 法具有回收率高[20]、溶劑使用量少、操作簡便、方法重現性好和易于標準化等優點，是目前應用較多的前處理凈化方法[21]。常用于抗吸蟲藥物殘留測定的分析方法有紫外-可見分光光度法[22]、膠體金免疫層析法[23]、薄層色譜法[24]、高效液相色譜法[25]、液相色譜熒光檢測法[26]和液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS）[27]等。其中，HPLC-MS/MS 法具有選擇性好[28]、靈敏度高[29]和定性與定量分析準確等優點[30]，是目前抗吸蟲藥物殘留的主要分析技術[31]，但檢測樣品多集中于液態牛羊奶產品，如Devreese 等[32]基于固相萃取凈化建立了HPLC-MS/MS 測定液態牛羊奶中氯氰碘柳胺殘留的方法，檢出限為10 μg/kg；李小橋[33]等基于液液萃取建立了超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）測定液態牛奶基質中三氯苯達唑及其代謝物三氯苯達唑酮殘留的方法，檢出限為1 μg/kg。目前，針對奶粉基質的相關高通量檢測方法研究仍鮮有報道。

本研究基于UHPLC-MS/MS，針對牛奶粉中常見抗吸蟲藥物（氯氰碘柳胺、硝碘酚腈、碘醚柳胺、三氯苯達唑及其代謝物三氯苯達唑酮）前處理凈化的關鍵環節，考察了多種商業化凈化材料（包括Captiva EMR-lipid 固相萃取柱、Captiva ND lipids 固相萃取柱、Cleanert LipoNo 除脂管和QuEChERS 凈化管）的使用效果，并優化了色譜分離條件和質譜分析參數，建立了適用于檢測奶粉中抗吸蟲藥物殘留的高通量分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

APUS PLUS 超高壓液相色譜儀（珂睿公司）；Triple Quad 6500+三重四極桿質譜儀（美國SCIEX 公司）；CR22N 型高速冷凍離心機（日本日立公司）；Turbo Vap?LV 型高通量水浴氮吹濃縮儀（美國Caliper 公司）。

乙腈和甲醇（質譜純，德國Merck 公司）；甲酸（質譜純，美國Fluka 公司）；甲酸銨（質譜純，德國Sigma 公司）；氨水、NaCl 和無水MgSO4（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。Captiva EMR-lipid 固相萃取柱（3 mL/300 mg，美國Agilent 公司）和Captiva ND lipids 固相萃取柱（3 mL/60 mg，美國Agilent 公司）；Cleanert LipoNo 除脂管（15 mL，天津博納艾杰爾公司）；N-丙基乙二胺（Primary secondary amine，PSA）和十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18，美國Agilent 公司）。實驗用水為超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm）。

氯氰碘柳胺（CAS 登錄號：57808-65-8，純度98.1%）和硝碘酚腈（CAS 登錄號：1689-89-0，純度98.8%）購于德國Dr.Ehrenstorfer 公司；碘醚柳胺（CAS 登錄號：22662-39-1，純度96.0%）和三氯苯達唑酮（CAS 登錄號：1201920-88-8，純度99.4%）購于加拿大Toronto Research Chemicals 公司；三氯苯達唑（CAS 登錄號：68786-66-3，純度98.8%）購于英國Laboratory of the Government Chemist 公司。分別稱取10 mg 標準品，用乙腈溶解并定容至10 mL，制備1 g/L 標準儲備溶液，于–20 ℃保存備用（此條件下可保存6 個月）。分別移取100 μL 相應標準儲備液于10 mL 容量瓶中，用乙腈定容，制備成混合標準中間溶液（10 mg/L），于–20 ℃保存備用（此條件下可保存1 個月）。混合標準工作液（1 mg/L）用乙腈-水（7∶3，V/V）溶液配制，現用現配。

1.2 樣品前處理

稱取（2.00±0.02）g 牛奶粉于離心管中，用4 mL 水溶解，混勻，加入16 mL 冰乙腈（將乙腈于–20 ℃預冷3 h），渦旋振蕩10 min，以10000 r/min 離心10 min，取上清液備用。

Captiva ND 法凈化流程 取10 mL 備用上清液于離心管中，加2 g NaCl，渦旋振蕩10 min，以10000 r/min 離心10 min，取5 mL 上清液，于40 ℃下氮吹至近3 mL，過Captiva ND lipids 固相萃取柱并抽干，收集濾出液，氮吹至近干。

Captiva EMR 法凈化流程 取5 mL 備用上清液，過Captiva EMR lipid 固相萃取柱并抽干，再用2 mL乙腈洗脫，收集全部濾出液，于40 ℃下氮吹至近干。

Cleanert LipoNo 法凈化流程 向上清液中加入2 g 無水MgSO4和0.5 g NaCl，渦旋振蕩5 min，以5000 r/min 離心3 min，取5 mL 上清液于Cleanert LipoNo 除脂萃取管中，渦旋振蕩5 min，以5000 r/min離心3 min，取2.5 mL 上清溶液，于40 ℃下氮吹至近干。

QuEChERS 法凈化流程 向離心管中加入4 g MgSO4和1 g NaCl，渦旋振蕩3 min，以10000 r/min 離心5 min，取8 mL 上清液轉移至裝有凈化劑的離心管（含50 mg PSA 和150 mg C18）中，渦旋振蕩5 min，以10000 r/min 離心5 min，取5 mL 上清溶液，于40 ℃下氮吹至近干。

將以上4 種氮吹至近干的提取殘渣用500 μL 乙腈-水（7:3，V/V）溶液復溶，渦旋并超聲1 min，15000 r/min 離心10 min，取上清液進行UHPLC-MS/MS 測定。

1.3 儀器條件

色譜條件 Waters CORTECS UPLC C18色譜柱（50 mm×3.0 mm，1.6 μm）。流動相A 為5 mmol/L 甲酸銨溶液，流動相B 為乙腈。梯度洗脫程序：0～0.1 min，15%B；0.1～2.2 min，15%～100%B；2.2～4.0 min，100%B；4.0～4.2 min，100%～15%B；4.2～5.5 min，15%B。自動進樣器溫度：15 ℃；流速：0.4 mL/min；進樣體積：5 μL；柱溫：30 ℃。

質譜條件 電噴霧電離（ESI）采用負離子模式；離子化電壓：–4500 V；氣化溫度：575 ℃；氣簾氣壓力：45.0 kPa（N2）；噴霧氣壓力：45 kPa（N2）；輔助加熱氣壓力：65 kPa（N2）；碰撞氣：Medium（N2）；檢測模式：多反應監測（MRM）模式。

目標分析物的色譜-質譜參數見表1。

表1 抗吸蟲藥物的化學信息及相關分析參數Table 1 Chemical information and analytical parameters of anthelmintics

1.4 基質效應評價

基質效應（Matrix effect，ME）的計算方法：ME=基質標準曲線斜率/溶劑標準曲線斜率。若ME <0.8，說明存在基質抑制效應；若ME >1.2，說明存在基質增強效應；若0.8

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的優化

奶粉基質成分復雜，含有大量蛋白質、脂質和碳水化合物等大分子，還可能含有低聚糖、不飽和脂肪酸和微量元素等營養成分，在前處理過程中需將這些干擾物有效去除。根據目標分析物的極性特點，選用提取后不通過乳化作用即可沉降蛋白質的乙腈作為提取溶劑。在低溫條件下，蛋白質結構相對穩定，不易與目標分析物結合而形成共沉淀，因此，采用預冷的冰乙腈可以有效去除蛋白質。

為更好地提升方法的分析性能和檢測通量，本研究針對牛奶粉基質的特點和目標分析物的理化性質，考察了4 種快速凈化固相萃取材料（Captiva ND lipids 固相萃取柱、Captiva EMR lipids 固相萃取柱、Cleanert LipoNo 除脂管和QuEChERS 凈化管）對空白奶粉基質添加目標分析物（10 μg/kg）的回收率的影響，結果見圖2。

圖2 不同凈化方法對空白基質添加（10 μg/kg）5 種目標分析物回收率的影響（n=3）Fig.2 Effects of different clean-up methods on spiking recoveries of 5 kinds of analytes at spiking concentration level of 10 μg/kg (n=3)

采用Cleanert LipoNo 除脂萃取管和Captiva ND lipids 固相萃取柱時，Closantel 和Rafoxanide 的回收率較低，推測其主要是因為Closantel 和Rafoxanide 的分配系數較大，具有較強的非極性，在相應填料上形成了非選擇性吸附而不易被洗脫。相比之下，基于QuEChERS 法和Captiva EMR lipids 固相萃取柱凈化的方法針對5 種目標分析物都具有比較好的回收率，并且在空白奶粉基質中添加（10 μg/kg）回收率的差異性不顯著（p>0.05）。其中，QuEChERS 法采用的填料為PSA 和C18，PSA 具有較強的離子交換能力，常用于吸附糖和色素等添加劑，C18常用于吸附脂肪等含長碳鏈的中等極性到非極性的化合物，因此吸附奶粉基質組分的能力較強，而碳鏈較短的目標分析物可以更好地被洗脫，因此整體回收率較高。Captiva EMR lipids 固相萃取柱是基于體積排阻和疏水相互作用機制去除脂質，在有效去除奶粉基質中磷脂的同時，可最大程度地減少離子抑制對目標分析物的影響，整體回收率也較好。對比QuEChERS 法，EMR 法采用濾過式凈化方式可有效縮短前處理時長，并且產生的廢物較少。綜合考慮回收率、處理通量和環境友好等因素，本研究最終選用Captiva EMR lipids 固相萃取柱作為凈化材料。此外，根據目標分析物的極性，優化了定容溶劑的組成，最終選用乙腈-水（7∶3，V/V）作為定容溶劑。

2.2 儀器分析條件的優化

由于目標分析物同時含有氨基和氯離子，因此，目標物在電噴霧電離負離子模式（ESI-）和正離子模式（ESI+）下均可以進行離子化，結果表明，ESI-模式下各目標分析物的電離效果較好，同時考慮到ESI-的背景響應低，因此選擇ESI-條件進行測定。采用混合標準工作液優選各目標化合物的碎片離子、優化碰撞能量和去簇電壓等質譜參數（表1）。本研究選用CORTECS UPLC C18色譜柱（50 mm×3.0 mm，1.6 μm），該柱分離效能好，在適中pH 值范圍內可實現穩定的酸、堿和中性化合物保留，短柱長有利于提升檢測通量。本研究選用乙腈-水流動相體系，并在水相中加入5 mmol/L 甲酸銨改善峰形，以減小拖尾和雙峰現象，通過優化梯度洗脫條件，可在5.5 min 內完成目標分析物的1 個測定循環。

在優化的色譜-質譜參數（表1）條件下，5 種目標分析物在空白基質溶液中和基質匹配定量限水平（2.5 μg/kg）標準溶液中的提取離子流圖見圖3A 和3B，在目標分析物的保留時間窗口內，基線豐度得到了有效控制。

圖3 （A）空白基質溶液和（B）2.5 μg/kg 基質匹配標準溶液中5 種目標分析物的提取離子流圖Fig.3 Extracted ion chromatograms of 5 kinds of analytes in(A)matrix blank solution and(B)matrix-matched standard solution (2.5 μg/kg)

2.3 方法驗證

2.3.1 方法的基質效應、線性范圍、檢出限和定量限

使用已經過確證不含5 種目標分析物的市售奶粉樣品作為本研究的空白基質。采用此空白基質繪制基質匹配標準曲線，配制濃度水平分別為1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 和100.0 μg/L 的基質匹配標準溶液，以目標分析物濃度為橫坐標、定量離子提取離子流色譜峰面積為縱坐標，最小二乘法回歸分析擬合標準曲線，得到各目標分析物的回歸方程和相關系數（r）。以標準曲線法計算3 倍信噪比（S/N=3）時的添加濃度為方法檢出限（Limit of detection，LOD），10 倍信噪比（S/N=10）時的添加濃度為定量限（Limit of quantification，LOQ），結果表明，各目標分析物的LOQ 遠小于其各自的MRLs（表2）。

表2 5種目標分析物的線性方程、相關系數、檢出限、定量限和基質效應Table 2 Linear equations,coefficients of correlation (r),limits of detection (LODs),limits of quantification (LOQs) and matrix effects (MEs) of 5 kinds of analytes

對基質效應（MEs）的評估結果見表2。由表2 可見，本方法對各目標分析物存在一定程度的基質增強效應（1.2

2.3.2 回收率與精密度

本研究采用基質空白添加進行回收率與精密度實驗。選擇空白牛奶粉樣品，依據5 種目標分析物的MRLs，選擇3 個添加水平（5.0、50.0 和80.0 μg/kg），按照1.3 節所述的前處理步驟，相當于目標分析物的濃度水平為5.0、50.0 和80.0 μg/L。每個水平于同日做6 個平行，計算實際測定值、回收率和日內相對標準偏差（Intra-relative standard deviations，Intra-RSDs），每隔2 天重復1 次前述實驗，重復3 次，計算日間相對標準偏差（Inter-RSDs）。本研究的平均回收率和RSD 結果見表3。

表3 奶粉樣品中5種目標分析物的加標回收率和相對標準偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of 5 kinds of analytes spiked in milk powder samples (n=6)

由表3 可知，目標分析物的平均回收率為93.2%～105.3%，日內相對標準偏差為1.2%～8.9%，日間相對標準偏差為2.8%～9.3%。在提取效率確定的情況下，影響方法回收率和精密度等關鍵性能指標的主要因素為樣品的前處理過程，本研究結果表明，本方法在保證高檢測通量（快速凈化）的同時也能保證性能指標的穩定。

2.4 方法的應用及穩健性評估

采用本方法對30 份市售牛奶粉產品（10 個品牌的1、2、3 段奶粉）進行以上5 種目標化合物的檢測，未在樣品中檢出抗吸蟲藥物殘留。

為驗證本方法的穩健性，對30 份不同日期不同分析批次的內部質控樣品（在定量限水平進行空白基質添加的樣品）進行平行測定（n=3）分析，回收率統計結果見電子版文后支持信息圖S1。結果表明，5 種目標分析物的質控結果均未超出各自的1 倍標準偏差范圍，說明本方法的穩健性良好。

3 結論

本研究針對牛奶粉中常用抗吸蟲藥物殘留，基于通過式固相萃取凈化的方式建立了高通量UHPLCMS/MS 測定分析方法。本方法的提取步驟簡單、快速，凈化方法可以有效控制牛奶粉的基質效應，儀器分析時長控制在5.5 min 內，大幅提高了樣品的分析通量。5 種常用抗吸蟲藥及其代謝物的方法定量限為2.61～4.95 μg/kg，日間精密度為2.8%～9.3%，指標滿足相關藥物的檢測監測分析要求，可用于奶粉中相關藥物殘留的監控與監測以及日常檢測。

支持信息

Supporting Information

圖S1 30 批次質控奶粉樣品中5 種目標分析物的定量測定質控圖：（A）氯氰碘柳胺；（B）硝碘酚腈；（C）碘醚柳胺；（D）三氯苯達唑；（E）三氯苯達唑酮Fig S1 Quality control charts of 5 kinds of analyts in quality control samples within 30 different analysis batches: (A) Closantel;(B) Nitroxinil;(C) Rafoxanide;(D) Triclabendazole;(E) Ketotriclabnedazole