附聚/超支化陰離子色譜固定相的制備和性能研究

韓宇 寧弘宇 戴徐鑫 黃忠平* 劉會君 朱巖

1（浙江工業大學化學工程學院，杭州 310014）

2（浙江大學化學系，杭州 310028）

1975 年，Small 等[1]首次提出抑制型離子色譜法，成功地解決了用電導檢測器連續檢測柱流出物的難題。抑制型離子色譜法被廣泛應用于食品安全[2-5]、環境監測[6-8]和生物醫藥[9]等行業。抑制型離子色譜法具有快速、靈敏、可同時測定多組分等優點，可以測定很多目前難以用其它方法測定的離子尤其是陰離子。因此，開發新型陰離子色譜固定相以滿足日益復雜的分離需求，已成為離子色譜領域的研究熱點。離子色譜中影響選擇性的關鍵因素是固定相，包括聚合物的基質組成[10]、離子交換基團的類型和結構等[11-12]。采用新的材料基質、新的修飾技術及更適宜的裝填方式等方法提高色譜柱的柱效、選擇性和分析速度等，已經成為該領域目前的主要研究方向。

聚電解質附聚型陰離子交換固定相是由陽離子聚電解質主鏈的功能基團通過靜電作用吸附于帶負電荷的基質表面制備得到[13-15]。陽離子聚電解質是一種水溶性高分子化合物，其鏈段帶有大量可電離基團，因此兼具小分子電荷基團和高分子長鏈的雙重結構特征[16]。尤其是季銨鹽類高分子化合物，已經成為近年來的研究熱點，發展較快、種類較多，是一類重要的功能性高分子聚電解質。Zhao 等[17]通過水熱碳化法將蔗糖轉化的碳質球作為基質，有效避免了有機聚合物基質與可極化陰離子之間的非離子相互作用，采用甲胺（MA）和1,4-丁二醇二縮水甘油醚（BDDE）制備聚電解質并接枝到表面。Zhang 等[18]通過巰基介導的聚合方法在聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）基質上引入氨基，采用2-（甲氨基）乙醇和BDDE 合成陽離子聚電解質，并與基質上的氨基反應，探究了巰基介導的聚合過程中形成的羧基/羥基中間層對固定相交換容量和疏水性的影響。超支化改性方法是在基質表面引入反應部位，然后通過縮合反應等方法接枝高支化聚合物，超支化層附著在基質表面，不穿透基底顆粒的孔隙，從而可以提高分離效率[19-22]。Uzhel 等[23]制備了3 種基于PS-DVB 的超支化陰離子交換劑，第一次循環分別采用甘氨酸、牛磺酸和乙醇胺與BDDE 反應，后4 次循環用甲胺（MA）與BDDE 反應，并比較了氨基取代基對固定相色譜性能的影響。Popov 等[24]采用PS-DVB 作為基質，在功能層結構中引入兩性離子片段制備了共價鍵超支化陰離子色譜固定相，在25 min 內實現了7 種常見陰離子的分離。

附聚型離子色譜固定相結合超支化修飾方法是現代商用固定相最主要的修飾形式[25]。Pohl 等[26]采用二環氧試劑和伯胺（摩爾比1∶1）在柱內磺化基質上原位生成線性結構的聚電解質，再進行二環氧試劑和伯胺試劑交替循環反應形成超支化層，已應用于商業化色譜柱（如IonPac AS19-24）生產。近年來，研究者多嘗試采用不同材質的固定相基質，或以不同的環氧和伯胺試劑制備聚電解質和超支化層，但未見類似柱內原位合成的研究報道。Huang 等[27]在PS-DVB 基質中嵌入氧化后的納米金剛石，提高了基質微球的機械強度，后續以BDDE 和MA 制備陽離子聚電解質和超支化層制備陰離子柱，在20 min 內實現了7 種陰離子的基線分離。Huang 等[28]以環氧氯丙烷和MA 為單體制備季銨鹽陽離子聚電解質和超支化層，15 min 內實現了5 種常規陰離子和3 種極化陰離子的分離。上述研究考察了固定相的選擇性受基質類型和二環氧試劑的結構、超支化修飾次數等的影響，但陽離子聚電解質的合成條件及修飾量對柱效和選擇性的影響尚未見報道。

柱容量、選擇性和柱效是評價離子色譜固定相的3 個主要指標。離子色譜固定相的柱容量和選擇性受洗脫條件、色譜柱溫[29]、超支化層數以及基質表面官能團的化學性質[30-31]等因素的影響；柱效主要由固定相基質類型[32]、基質修飾方式[12]和裝填方式[33]決定。本研究以PS-DVB 微球為基質，通過BDDE 和MA 制備陽離子聚電解質層，考察了聚電解質的合成條件及修飾量、基質微球的孔徑和超支化次數對固定相分離度及柱效的影響，確定了最佳的合成條件。此外，對固定相的批間重現性及穩定性進行了考察。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ICS-1100 離子色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；ZD-10 裝柱機（大連日普利公司）；TG-16-WS 臺式高速離心機（湖南湘儀公司）；SK2510HP 超聲波清洗儀（上海KUDOS 公司）；SHZ-D Ⅲ循環水式真空泵（鞏義予華公司）；不銹鋼柱（150 mm×4.6 mm，大連日普利公司）。

10 μm PS-DVB 微球（孔徑分別為10 和30 nm，蘇州納微科技有限公司）；BDDE（60%）、MA（40%）和冰醋酸（99.5%）購自上海阿拉丁公司；NaF、NaBr、NaNO2和NaNO3（99%）購自上海麥克林公司；Na3PO4（99%）購自宜興第二化學試劑廠；（NH4）2SO3（99%）購自上海五四化學試劑廠；Na2CO3（99.8%）購自太倉美達試劑公司；NaHCO3（99.5%）購自溫州市化學用料廠。所用試劑均為分析純；實驗用水為去離子水。

1.2 實驗方法

將購買的PS-DVB 微球乳液用循環水式真空泵抽濾，再用無水乙醇洗滌2～3 次，置于60 ℃烘箱中烘干，備用。

1.2.1 固定相的制備

參考文獻[26]的方法合成陽離子聚電解質。配制40 mL BDDE（10%，m/V）溶液，加入250 mL 三口燒瓶中，水浴升溫至60 ℃，用恒壓漏斗在1 h 內滴加40 mL 甲胺（4%，m/V）溶液，滴加完成后冷卻至室溫。將制備的陽離子聚電解質以5000 r/min 離心5 min，棄去沉淀，備用。

參考文獻[26]的方法對基質磺化和陽離子聚電解質的附聚接枝。取2.5 g PS-DVB 微球置于250 mL三口燒瓶中，加入15 mL 冰醋酸攪拌10 min。在30 ℃下加入3 mL 二氯甲烷溶脹，攪拌30 min。緩慢滴加7 mL 濃H2SO4，攪拌3 min 后將反應液倒入1 mol/L 冰的稀H2SO4中猝滅。將磺化微球用去離子水反復清洗至過濾液為中性。將磺化后的基質超聲分散于100 mL 去離子水中，在40 ℃水浴中，加入80 mL陽離子聚電解質，恒溫攪拌附聚24 h，用去離子水洗滌至過濾液呈中性。將微球超聲分散于100 mL 去離子水中，置于60 ℃水浴中，倒入20 mL BDDE 水溶液反應30 min，用去離子水洗滌3 次。將微球重新分散于100 mL 去離子水中，置于60 ℃水浴中，加入20 mL 甲胺溶液，反應30 min，完成一次接枝反應。反應路線如圖1 所示。

1.2.2 固定相的裝填

將固定相分散于60 mL 去離子水中形成勻漿液，將勻漿液倒滿勻漿罐，在20 MPa 壓力下進行填充，勻漿液以及頂替液均為去離子水，待流出液為500 mL 時裝柱停止，在30 min 內緩慢降低流速將壓力降為0 MPa。將色譜柱拆下后，以2 mmol/L Na2CO3和2 mmol/L NaHCO3溶液為流動相，流速為1.0 mL/min，沖洗平衡6 h 后，備用。

1.2.3 標準溶液的配制

采用賽默飛世爾科技有限公司IonPac AS19-24 商品柱性能報告中的7 種典型陰離子（F–、Cl–、NO2–、Br–、NO3–、PO43–和SO42–）評價自制色譜柱的分離性能。稱取相應質量的NaF、NaCl、NaNO2、NaBr、NaNO3、Na3PO4?10H2O 和（NH4）2SO4，配制成濃度為1000 mg/L 的儲備液，于4 ℃保存備用。將各離子的單標溶液配制成相應濃度（F–為2 mg/L，Br–為20 mg/L，NO2–為10 mg/L，Cl–為5 mg/L，NO3–為20 mg/L，PO43–為30 mg/L，SO42–為10 mg/L）的混合標準溶液。

1.2.4 色譜條件及柱容量的測定

色譜條件 在未特別注明的情況下，采用的色譜柱均為不銹鋼柱（150 mm×4.6 mm）；流動相：2.0 mmol/L Na2CO3和2.0 mmol/L NaHCO3的混合溶液；流速：1.0 mL/min；進樣量：25 μL；抑制電流：25 mA；柱溫：30 ℃；檢測器：電導檢測器。

柱容量的測定 用1.0 mol/L NaCl 溶液在高壓泵上以1.0 mL/min 流速沖洗色譜柱6 h，使所有季銨基吸附位點帶上Cl–。采用去離子水以相同的流速沖洗色譜柱6 h，沖出柱中游離的Cl–。最后，采用2.0 mmol/L Na2CO3和2.0 mmol/L NaHCO3的混合液以1.0 mL/min 流速沖洗色譜柱6 h，并收集洗出液，用離子色譜檢測洗出液中Cl–的含量。

2 結果與討論

2.1 陽離子聚電解質的合成優化

在制備過程中，MA 與BDDE 反應時易發生凝膠結塊現象，所得的陽離子聚電解質在與磺化基質附聚后結構不穩定，并且接枝兩次后不能實現7 種常見陰離子的基線分離。通過調節恒壓漏斗活塞控制MA 的滴加速率制備陽離子聚電解質，分別調整滴加速率使得甲胺溶液在0.5 和1.0 h 內加至BDDE 中。兩種不同的MA 流速下制備的陽離子聚電解質均未發生凝膠結塊的情況。以兩種方式制備的陽離子聚電解的色譜分離圖如圖2 所示，經過附聚接枝后，兩種色譜性能差異明顯。基質微球附聚0.5 h 內滴加MA 制備的陽離子聚電解所得的固定相，可對7 種常規陰離子進行初步的分離，而在1.0 h 內滴加MA 制備的陽離子聚電解質所得的固定相對陰離子保留較弱。然而，通過后續的接枝修飾后，情況卻發生了相反的變化，如圖2A 所示，附聚后對陰離子有初步分離能力的固定相未能實現7 種陰離子的分離；但是，附聚后對陰離子保留較弱的固定相卻在兩次接枝后具有較好的選擇性，實現了7 種陰離子的基線分離，如圖2B 所示。在1.0 h 內滴加MA 控制反應速率，使聚合的電解質呈線性生長，避免反應速率過快導致電解質聚合封閉成環。因此，后續實驗采用在1.0 h 內滴加MA 制備陽離子聚電解質。

圖2 7 種常規陰離子在固定相上分離的色譜圖：（A）在0.5 h 內滴加40 mL MA 制備陽離子聚電解質制備的固定相；（B）在1 h 內滴加40 mL MA 制備陽離子聚電解質制備的固定相Fig.2 Chromatograms of separation of seven conventional anions on cationic polyelectrolyte agglomeration stationary phases prepared by dropping 40 mL of methylamine within(A) 0.5 h and (B) 1 h,respectively

2.2 不同附聚修飾量的固定相的色譜性能對比

采用不同量的陽離子聚電解質與磺化基質進行附聚及接枝修飾，并測試了所制備的固定相的色譜性能。如圖3 所示，經過2 次接枝修飾反應后，采用不同量陽離子聚電解質附聚制備的固定相色譜性能相近，柱效都維持在同一水平。但是，Br–峰型不同，通過計算Br–峰的不對稱因子（峰不對稱因子：峰兩側峰高10%處距峰值位置的距離之比）可知，在采用40 mL 陽離子聚電解質附聚時，所制備的固定相對Br–的峰不對稱因子為1.35，不對稱因子較大。但是，當附聚的陽離子聚電解質體積達到80 mL 時，Br–峰型有所改善，不對稱因子為1.12。磺化基質表面需要附聚足夠量聚電解質，以消除基質對離子的作用力。聚電解質量為40 mL 時，附聚量不足，使得部分微球基質表面暴露于流動相中，導致Br–峰的不對稱因子較大。當聚電解質量增大至80 和120 mL 時，色譜柱性能沒有變化，說明磺化基質表面已經有足夠量的聚電解質進行附聚。因此，后續研究采用80 mL 陽離子聚電解質附聚在磺化的基質上。

圖3 采用（A）40 mL、（B）80 mL 和（C）120 mL 陽離子聚電解質附聚制備的固定相的色譜分離圖Fig.3 Chromatograms of stationary phase prepared by attachment of 40 mL(A),80 mL (B) and 120 mL(C) of cationic polyelectrolyte

2.3 不同孔徑基質的色譜性能

考察了10 nm 孔徑的10 μm 微球與30 nm 孔徑的10 μm 微球基質在相同條件下制備的固定相的色譜性能，結果如圖4 所示，兩種基質的固定相均能實現7 種常規陰離子的基線分離。在相同的流動相條件下，采用孔徑10 nm 的基質微球制備的固定相對常規陰離子的分離度更大，但是保留時間過長；而孔徑30 nm的基質微球可在20 min 內實現分離，相較孔徑10 nm 的基質微球具有更快的分析速度。原因在于孔徑10 nm 的基質微球比孔徑30 nm 的基質微球具有更大的比表面積，能夠附聚更多量的陽離子聚電解質，因此同樣量的固定相其交換容量越大，保留能力越強。后續研究均采用孔徑30 nm 微球基質制備固定相。

圖4 （A）孔徑30 nm 和（B）孔徑10 nm 微球制備的基質色譜性能的對比Fig.4 Comparison of chromatographic performance of different stationary phase matrices: (A) Pore size of 30 nm;(B) Pore size of 10 nm

2.4 不同接枝次數的固定相色譜性能對比

陽離子聚電解質通過靜電力與范德華力作用附聚于磺化的PS-DVB 微球基質的表面，形成類似核殼結構的薄膜[13-14]，而離子交換固定相的功能基團是季銨基，微球表面的季銨功能基團的數量可以通過接枝次數控制，因此本研究考察了不同接枝修飾次數固定相的色譜性能。如圖5 所示，接枝2 次和3 次的固定相具有良好的選擇性，接枝3 次的固定相柱容量為0.43 mmol/column，高于接枝2 次的固定相（0.27 mmol/column）。當接枝4 次時，固定相柱容量上升至0.54 mmol/column，但選擇性下降，NO3–與PO43–無法達到基線分離。接枝5 次后固定相的選擇性進一步下降。推測是隨著接枝次數增加，基質表面季銨功能基團數量增多，基質表面的電荷密度變小，造成柱效與選擇性下降[34-35]。后續研究均對附聚后的微球基質接枝2 次制備固定相。

圖5 不同接枝次數的固定相色譜性能的對比Fig.5 Comparison of chromatography performances of stationary phases with different numbers of grafting

2.5 固定相的評價

2.5.1 固定相的批次間重現性

在確定了色譜固定相合成的最佳條件后，考察了批次間合成的重現性。在2 個月內合成了8 批次的柱填料，并分別按照相同步驟進行色譜柱的裝填，采用7 種常規陰離子的混合標準溶液進行色譜性能測試，結果如圖6 與表1 所示，所有批次的柱填料均在相同色譜條件下測試，固定相的背景壓力均小于4.83 MPa。對于SO42–，所有批次固定相的柱效均大于30000 N/m，峰不對稱因子在0.98～1.24 之間，保留時間在22.71～25.85 min 之間。因此，本研究中的固定相的合成與填裝方法的重現性良好，具有實現產業化的基礎。

表1 不同批次固定相的色譜性能數據Table 1 Chromatographic performance data of different batches of stationary phase

圖6 不同批次固定相的色譜分離圖Fig.6 Chromatographic separation diagrams of different batches of stationary phases

2.5.2 固定相的穩定性

在相同的色譜條件下，采用7 種常規陰離子混合標準液進行了100 次分離測試，并每隔4 針選取1 針分析結果進行色譜圖的疊加繪制，如圖7 所示，各離子保留時間的RSD 均不超過1.1%，峰高與峰面積的RSD 均小于6%，表明此固定相具有良好的穩定性和耐久性。

圖7 7 種常見陰離子在固定相上的分離疊加圖Fig.7 Separation and superimposition diagram of 7 kinds of common anions on the stationary phase

3 結論

考察了影響附聚型陰離子色譜固定相柱效和分離度的因素，解決了聚陽離子電解質在合成過程中容易產生凝結及難以重現的問題，探究了聚陽離子電解質對固定相柱效及分離度的影響。優化后的固定相性能良好，背景壓力低且塔板數較多，柱效較高，可在30 min 內實現7 種常規陰離子的分離，并且重現性和穩定性良好。本研究為制備聚附型陰離子固定相的產業化提供了良好的技術參考。