二甲雙胍對彌漫大B細胞淋巴瘤細胞的抑制作用及機制探討

譚春蓮　李曉紅　夏國棟　張志紅　李曉明

摘要：目的 探討二甲雙胍對人彌漫大B細胞淋巴瘤（DLBCL）U2932細胞的抑制作用及其相關機制。方法 采用不同濃度二甲雙胍作用于體外培養的U2932細胞，分為對照組（0 mmol/L）和二甲雙胍實驗組（分別為5、10、20、40 mmol/L），分別培養24、48、72 h。通過CCK-8法檢測細胞增殖活性改變；流式細胞術檢測細胞周期分布及凋亡情況；Western blot檢測AMP活化蛋白激酶（AMPK）、細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、自噬及凋亡等通路相關蛋白的表達水平。結果 經二甲雙胍處理后的U2932細胞存活率較對照組明顯下降（P＜0.05）。5、10和20 mmol/L二甲雙胍組G0/G1期細胞比例均較對照組增加（P＜0.05）。20 mmol/L二甲雙胍組24 h、48 h、72 h的細胞凋亡比例較對照組增加（P＜0.05）。與對照組相比，5、10和20 mmol/L二甲雙胍組磷酸化AMP活化蛋白激酶α亞基（p-AMPKα）、P53、B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）關聯X蛋白（Bax）、活化的胱天蛋白酶3（Cleaved Caspase-3）、微管相關蛋白l輕鏈3B亞基（LC3B）蛋白表達水平增加，細胞自噬蛋白Beclin1表達水平僅部分增加，Bcl-2、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、CyclinD1蛋白表達水平降低（P＜0.05）。結論 二甲雙胍能夠激活AMPK、凋亡及自噬通路，抑制U2932細胞增殖，促進其凋亡。

關鍵詞：二甲雙胍；淋巴瘤，大B細胞，彌漫性；AMP活化蛋白激酶類；細胞凋亡；細胞增殖；自噬；信號通路

中圖分類號：R733.41文獻標志碼：ADOI：10.11958/20220684

Inhibitory effect and mechanism of metformin on diffuse large B-cell lymphoma cells

TAN ChunlianLI Xiaohong XIA Guodong ZHANG Zhihong LI Xiaoming

1 Health Management Center， 2 Department of General Medicine， 3 Department of Hematology， the Affiliated Hospital of Southwest Medical University， Luzhou 646000， China

Corresponding Author E-mail： zhihonglily@126.com

Abstract： Objective To investigate the inhibitory effect and related mechanism of metformin on human diffuse large B-cell lymphoma （DLBCL） U2932 cells. Methods U2932 cells cultured in vitro were treated with different concentrations of metformin， and cells were divided into the control group （0 mmol/L） and the metformin experimental groups （5， 10， 20 and 40 mmol/L）. Cells were cultured for 24 h， 48 h and 72 h， respectively. Changes of cell proliferation activity were detected by CCK-8 assay. Cell cycle distribution and apoptosis were detected by flow cytometry. Expression levels of AMPK， CyclinD1， autophagy and apoptosis pathway-related proteins were detected by Western blot assay. Results The proliferation activity of U2932 cells treated with metformin was significantly lower than that of the control group （P＜0.05）. Compared with the control group， the percentage of cells in G0/G1 phase treated with 5， 10， 20 mmol/L metformin and the apoptosis rate of U2932 cells treated with 20 mmol/L metformin for 24 h， 48 h and 72 h were significantly increased （P＜0.05）. Western blot assay showed that 5， 10， 20 mmol/L metformin could up-regulate the expression of p-AMPKα， P53， Bax， Cleaved Caspase-3， LC3B proteins， but Beclin1 only partially increased， and down-regulate the expression levels of Bcl-2， p-AKT， CyclinD1 proteins in U2932 cells （P＜0.05）. Conclusion Metformin can activate AMPK， apoptosis and autophagy pathways， inhibit the proliferation of U2932 cells， and promote their apoptosis.

Key words： metformin; lymphoma， large B-cell， diffuse; AMP-activated protein kinases; apoptosis; cell proliferation; autophagy; signaling pathway

淋巴瘤起源于淋巴結和淋巴組織。其發生大多與免疫應答過程中淋巴細胞增殖分化產生的某種免疫細胞惡變有關，是免疫系統的惡性腫瘤。按組織病理學分類可分為霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL）和非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）。NHL易早期發生遠處轉移，患者預后明顯差于HL。彌漫大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是一種遺傳復雜且異質性很強的侵襲性NHL，也是我國人群最常見的淋巴瘤類型，約占所有淋巴瘤的33.27%，其發病率呈逐年上升趨勢［1］。DLBCL具有多種臨床和病理特征，容易出現預后不良和頻繁復發，治療極具挑戰性［2］。AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）及磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B/the mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR）信號通路在細胞自噬與凋亡過程中起著關鍵作用。有研究認為，二甲雙胍可通過激活AMPK及抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路發揮抗腫瘤效應 ［3］。但關于二甲雙胍對DLBCL的作用機制卻鮮有報道。本研究以人DLBCL細胞系U2932為實驗對象，初步探究二甲雙胍對DLBCL細胞生物學特性的影響，以期揭示二甲雙胍對DLBCL是否具有潛在治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 人彌漫大B細胞淋巴瘤細胞系U2932細胞株購自南京科佰生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器 鹽酸二甲雙胍標準品（北京索萊寶科技有限公司）；胎牛血清、RPMI1640無血清培養基（美國Gibco公司）；CCK-8試劑盒（日本同仁化學研究所）；青霉素-鏈霉素溶液、細胞周期檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、流式細胞儀（美國Becton Dickinson公司）；兔抗人β-肌動蛋白（β-actin）抗體、兔抗人磷酸化AMPKα亞基（p-AMPKα）抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG購自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗人細胞自噬蛋白Beclin1、微管相關蛋白l輕鏈3B亞基（LC3B）抗體購自英國Abcam公司；兔抗人磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、P53、活化的胱天蛋白酶3（Cleaved Caspase-3）、B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2關聯X蛋白（Bax）抗體均購自杭州華安生物技術有限公司；酶標測定儀（美國Thermo公司）；蛋白凝膠電泳儀、垂直電泳槽、小型Trans-Blot轉印槽、凝膠成像分析系統（美國Bio-Rad公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養 U2932為懸浮細胞，采用含100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，放至37 ℃、5%CO2孵化箱內恒溫培養。

1.3.2 CCK-8法檢測細胞增殖活性 取生長狀態良好的U2932細胞，按（3～5）×105/mL的細胞密度接種至96孔板中培養，分別使用5、10、20、40 mmol/L二甲雙胍處理細胞，分別為5、10、20、40 mmol/L組，另設置對照組（二甲雙胍0 mmol/L）和空白組（不含二甲雙胍及細胞），每組5個復孔。分別培養24、48、72 h后添加10 μL CCK-8試劑，避光孵育3.5 h后檢測450 nm波長處光密度（OD），并計算半數抑制濃度（IC50）和細胞存活率，細胞存活率=（實驗組OD-空白組OD）/（對照組OD-空白組OD）×100%，實驗重復3次。

1.3.3 流式細胞術檢測細胞周期 在6孔板中接種對照組、5 mmol/L組、10 mmol/L組和20 mmol/L組細胞（1×106個/孔），培養48 h后轉至離心管，PBS洗滌后乙醇固定過夜，750 r/min離心5 min，PBS洗滌，加入PI染色30 min后，流式細胞儀檢測細胞周期，實驗重復3次。

1.3.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 將對照組及IC50組（本實驗選用20 mmol/L）細胞接種至6孔板（1×106個/孔），培養24、48、72 h后，750 r/min離心5 min，PBS洗滌2次，加入Binding Buffer（200 μL）重懸，添加5 μL被FITC熒光素標記的Annexin V及5 μL的碘化丙啶（PI）混勻，避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，實驗重復3次。

1.3.5 Western blot檢測細胞蛋白表達水平 將已培養至對數生長期的U2932細胞接種至對照組、5 mmol/L組、10 mmol/L組和20 mmol/L組培養瓶（2×106個/瓶），經培養48 h后提取各組細胞總蛋白，12 000 r/min離心10 min，棄細胞碎片，BCA法測定蛋白質濃度。各組取約15 μg蛋白，通過SDS-PAGE分離，轉至PVDF膜，常溫封閉1 h，加入兔抗p-AMPKα、p-AKT、CyclinD1、P53、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax、LC3B、Beclin1抗體（1︰1 000），置于4 ℃搖床過夜。次日漂洗3次后加入HRP標記的山羊抗兔二抗IgG（1︰1 000）室溫孵育1 h，洗膜后加ECL試劑顯色，置于凝膠成像儀中觀察并拍照，以β-actin作為內參，使用Image J軟件對條帶進行定量分析。蛋白相對表達量=目標蛋白灰度值/內參蛋白灰度值，實驗重復3次。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數據分析，Graphpad Prism 8.0軟件作圖。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（x ±s）表示，兩組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 二甲雙胍對U2932細胞增殖活性的影響 與對照組相比，經二甲雙胍處理后的U2932細胞存活率在72 h內明顯下降（P＜0.05），見表1。24 h、48 h 和72 h的IC50分別為48.514、19.423、12.715 mmol/L。

2.2 二甲雙胍對U2932細胞周期的影響 與對照組相比，5 mmol/L、10 mmol/L和20 mmol/L二甲雙胍處理U2932細胞48 h后，G0/G1期細胞百分比增加，S期、G2/M期細胞百分比降低（P＜0.05），10 mmol/L組和20 mmol/L組G0/G1期細胞百分比差異無統計學意義（P＞0.05），見表2、圖1。

2.3 二甲雙胍對U2932細胞凋亡的影響 與對照組相比，20 mmol/L二甲雙胍處理后的U2932細胞凋亡比例在24 h（28.06%±4.85% vs. 8.95%±1.54%，t=4.251）、48 h（37.16%±1.79% vs. 11.73%±2.08%，t=5.404）及72 h（57.07%±0.91% vs. 16.44%±2.27%，t=3.299）升高（n=3，均P＜0.01），見圖2。

2.4 二甲雙胍對U2932細胞AMPK、AKT、CyclinD1以及P53通路蛋白表達的影響 與對照組相比，5 mmol/L、10 mmol/L和20 mmol/L二甲雙胍組p-AMPKα、P53蛋白表達水平增加，p-AKT、CyclinD1蛋白表達水平降低（P＜0.05）；10 mmol/L組和20 mmol/L組P53蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3、表3。

2.5 二甲雙胍對U2932細胞凋亡、自噬相關蛋白表達的影響 與對照組相比，5 mmol/L、10 mmol/L和20 mmol/L二甲雙胍組Cleaved Caspase-3、Bax及LC3B蛋白表達水平增加，Bcl-2蛋白表達水平降低（P＜0.05）；10 mmol/L組和20 mmol/L組Beclin1蛋白表達水平較對照組增加（P＜0.05），5 mmol/L組未見顯著變化（P＞0.05），見圖4、表4。

3 討論

DLBCL是臨床中十分常見的淋巴瘤類型，其分子生物學特征及個體預后差異很大，約有1/3的患者無法治愈，存在復發、難治的普遍現象［2］。二甲雙胍是臨床廣泛使用的口服降糖藥物，近年來在抗腫瘤領域報道頗多，其機制較為復雜，包括調控多級代謝通路、抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞發生自噬與凋亡等［4］。而目前其對DLBCL的作用機制尚未闡明，因此擬通過必要的研究探討，以尋求新的治療方式及干預藥物。

3.1 二甲雙胍在腫瘤防治中的研究 近年來研究表明，二甲雙胍不僅作為降糖藥物來使用，其在腫瘤防治方面的作用已逐漸被流行病學研究和薈萃分析證實，包括乳腺癌［5］、前列腺癌［6］及胰腺癌［7］等。在血液系統腫瘤中也有類似的結論，二甲雙胍可降低2型糖尿病患者罹患NHL的風險［8］，還可改善新診斷的DLBCL和濾泡性淋巴瘤患者的臨床預后［9］。陳惠麗等［10］的體外研究也證實二甲雙胍可抑制白血病細胞增殖，誘導自噬與凋亡。而AMPK、AKT/mTOR等信號通路可能是其作用機制之一［11］。本研究結果顯示二甲雙胍能抑制U2932細胞的生長和增殖，阻滯細胞周期，與Xiong等［12］得出的二甲雙胍抑制腫瘤細胞增殖結果相似。

3.2 二甲雙胍對DLBCL的作用機制探討 目前多數研究領域認為AMPK作為一種腫瘤抑制激酶，同時也是二甲雙胍發揮抗腫瘤作用的關鍵靶分子。而PI3K/AKT/mTOR是AMPK重要的下游信號通路，在人類腫瘤細胞中往往是失控的，導致腫瘤細胞的快速增殖。二甲雙胍可通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路降低人子宮內膜癌細胞增殖［13］，在甲狀腺癌細胞株中也發現類似的作用［14］。此外，Zhang等［15］研究認為AKT的過度磷酸化可誘導肝癌的發生，而二甲雙胍可下調p-AKT的表達，降低AKT轉染細胞Cyclin D1的表達，從而減輕脂質沉積，緩解動物肝臟的脂肪變性，對AKT誘導的肝細胞腫瘤有治療作用。而p53是一種抑癌基因，與腫瘤的發生發展密切相關。最新研究證實APR-246（恢復突變型p53活性的化合物）可誘導DLBCL細胞發生自噬，抑制其增長［16］。還有研究表明，二甲雙胍能增強Bcl-2抑制劑的促凋亡作用，并發揮協同抗淋巴瘤效應［17］。本研究發現，不同濃度二甲雙胍干預U2932細胞48 h后p-AMPK蛋白表達逐漸增強，同時p-AKT表達逐漸減弱，表明二甲雙胍發揮抗腫瘤效應可能與激活AMPK及抑制AKT信號通路有關。其次，二甲雙胍可下調Cyclin D1、上調P53蛋白的表達，參與細胞增殖與細胞周期的調控。此外，與對照組相比，5、10和20 mmol/L二甲雙胍組的Bax、Cleaved Caspase-3及LC3B蛋白表達水平逐漸增加、Bcl-2蛋白表達水平逐漸降低，推測可能與細胞發生凋亡和自噬有關。但5 mmol/L二甲雙胍組與對照組的Beclin1蛋白表達水平無顯著差異，可能與高濃度二甲雙胍更容易誘導腫瘤細胞發生自噬或其他機制有關。

綜上所述，二甲雙胍在體外有顯著抑制U2932細胞增殖的作用，其抗腫瘤效應可能與激活AMPK信號通路，誘導細胞發生自噬與凋亡有關。本研究為了解二甲雙胍對DLBCL的作用機制提供了參考，有助于尋找治療DLBCL的潛在有效藥物，但仍需體內實驗進一步驗證。

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（2022-06-20收稿 2022-11-15修回）

（本文編輯 李鵬）