IVF/ICSI助孕后早期流產患者蛻膜組織焦亡相關因子表達水平的研究

車小群　王麗蓮　王笑　許麗華　馬天仲　荊霞　陳碧

摘要：目的 探討體外受精（IVF）/卵胞漿內單精子注射（ICSI）助孕妊娠后早期流產患者蛻膜組織中焦亡相關因子的表達及作用。方法 選取行IVF/ICSI助孕妊娠后早期流產患者102例（研究組），同期因意外妊娠行人工流產術的患者100例（對照組），收集蛻膜組織。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法及Western blot法檢測蛻膜組織中焦亡相關因子Nod樣受體蛋白3（NLRP3）、白細胞介素（IL）-1β、胱天蛋白酶1（Caspase1）、gasdermin D（GSDMD） mRNA及蛋白表達，TUNEL法檢測蛻膜組織中細胞焦亡情況，Pearson法分析蛻膜組織中細胞焦亡率與NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD蛋白水平的相關性。結果 與對照組相比，研究組蛻膜組織中NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD mRNA及蛋白水平、蛻膜組織中細胞焦亡率升高（P＜0.05）；研究組患者蛻膜組織中細胞焦亡率與NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD蛋白表達水平均呈正相關（r分別為0.429、0.474、0.498、0.540，均P＜0.05）。結論 IVF/ICSI助孕妊娠后早期流產患者蛻膜組織中焦亡相關因子NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD表達均升高，且與蛻膜組織細胞焦亡有關。

關鍵詞：流產，治療性；受精，體外；精子注射，細胞質內；蛻膜組織；Nod樣受體蛋白3；白細胞介素-1β；胱天蛋白酶1；gasdermin D

中圖分類號：R711.6文獻標志碼：ADOI：10.11958/20220918

Study on the expression of pyrolysis-related factors in the decidua tissue of patients with early abortion after IVF/ICSI assisted pregnancy

CHE Xiaoqun， WANG Lilian， WANG Xiao， XU Lihua， MA Tianzhong， JING Xia， CHEN Bi

Reproductive Center， Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Zhanjiang 524001， China

Corresponding Author E-mail： chenbi9677@163.com

Abstract： Objective To investigate the expression and effect of pyrodeath related factors in decidual tissue of in vitro fertilization （IVF）/intracytoplasmic sperm injection （ICSI） assisted early postpregnancy abortion. Methods A total of 102 patients with early abortion after IVF/ICSI assisted pregnancy were selected as the research group， and 100 patients who underwent artificial abortion due to unexpected pregnancy during the same period were selected as the control group. Samples of decidua tissue were collected. Quantitative real-time PCR （qRT-PCR） method and Western blot assay were used to detect expression levels of Nod-like receptor pyrin domain 3 （NLRP3）， interleukin-1β （IL-1β）， Cysteinyl aspartate specific proteinase 1 （Caspase1）， gasdermin D （GSDMD） mRNA and protein in decidua tissue. TUNEL method was used to detect the cell pyroptosis in decidua tissue. Pearson method was used to analyze the correlation between pyroptosis rate and the protein levels of NLRP3， IL-1β， Caspase1 and GSDMD in decidua. Results Compared with the control group， expression levels of NLRP3， IL-1β， Caspase1， GSDMD mRNA and protein， the cell pyroptosis rate in decidua tissues were significantly increased in the research group （P＜0.05）. There was a positive correlation between cell pyroptosis rate in decidua tissue and expression levels of NLRP3， IL-1β， Caspase1 and GSDMD in the research group （r=0.429， 0.474， 0.498， 0.540， all P＜0.05）. Conclusion The expression levels of pyrolysis-related factors NLRP3， IL-1β， Caspase1 and GSDMD in decidua tissue are increased in patients with early abortion after IVF/ICSI assisted pregnancy， and which are related to the cell pyroptosis of decidua tissue.

Key words： abortion， therapeutic; fertilization in vitro; sperm injections， intracytoplasmic; decidua tissues; Nod-like receptor pyrin domain 3; interleukin-1β; cysteinyl aspartate specific proteinase 1; gasdermin D

不孕不育是與生活環境、心理壓力、身體健康狀況等多種因素有關的疾病，近年來其發病率不斷升高，且趨于年輕化，嚴重影響家庭和諧［1］。體外受精（in-vitro fertilization，IVF）/卵胞漿內單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）是重要的生育輔助技術，在不孕癥治療中應用廣泛［2］。研究顯示，IVF/ICSI助孕妊娠可將臨床妊娠率由15%～20%提高到40%～50%，但妊娠12周前患者自然流產風險仍較高，單胎活產率僅35%左右［3］。研究IVF/ICSI助孕妊娠后早期流產的相關影響因素具有重要價值。妊娠的正常維持有賴于胎盤組織細胞凋亡、增殖的動態平衡，而在妊娠早期，承擔著分化發育成胎盤的絨毛組織以及為受精卵提供保護、營養的蛻膜組織在維持妊娠方面發揮重要作用［4-5］。研究發現，Nod樣受體蛋白3（nod-like receptor pyrin domain3，NLRP3）炎癥小體介導的母胎相關炎癥在復發性自然流產發病過程中發揮重要作用［6］。細胞焦亡是近年來發現的一種依賴于炎癥反應的細胞程序性死亡方式［7］，但鮮見其在IVF/ICSI助孕妊娠后早期流產中作用的相關研究。本研究旨在探討IVF/ICSI助孕妊娠后早期流產患者蛻膜組織中焦亡相關因子NLRP3、白細胞介素（IL）-1β、胱天蛋白酶1（Caspase1）、gasdermin D（GSDMD）的mRNA及蛋白表達水平，以期為相關研究提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2019年10月—2020年10月于廣東醫科大學附屬醫院生殖中心首次行IVF/ICSI助孕妊娠后早期流產患者102例（研究組），年齡（32.52±8.09）歲，體質量指數（BMI）（23.64±4.05）kg/m2，孕（8.53±2.25）周。選取同期在本院婦科門診因意外妊娠行人工流產術的患者100例（對照組），均為單胎妊娠，年齡（30.84±8.72）歲，BMI（22.89±4.26）kg/m2，孕（8.93±2.40）周。排除標準：（1）合并單側卵巢畸形、子宮畸形、子宮內膜異位癥、宮腔粘連、基礎內分泌疾病、染色體異常及異位妊娠者。（2）未收集到蛻膜組織者。（3）有明顯誘因流產者。（4）年齡、孕周、孕產次、基礎疾病等臨床資料不完整者。2組年齡（t=1.420）、BMI（t=1.283）、孕周（t=1.222）差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。收集所有患者新鮮蛻膜組織，生理鹽水沖洗干凈，分為2份，分別于-80 ℃冷凍保存及4%多聚甲醛固定后石蠟包埋保存。本研究獲得本院倫理委員會審核批準（PJ2019105），患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 SYBR One-Step實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）試劑盒（貨號：abs60038）購自愛必信（上海）生物科技有限公司；NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD、GAPDH羊抗兔一抗（貨號：ab263899、ab216995、ab207802、ab210070、ab9485）購自英國Abcam公司；TUNEL試劑盒（貨號：T2190）購自北京索萊寶科技有限公司；StepOne Plus熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；GelDocEZ凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司；SMZ745光學顯微鏡購自日本尼康公司。

1.3 qRT-PCR法檢測蛻膜組織中NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD mRNA表達水平 取部分冷凍的蛻膜組織，TRIzol法提取總RNA，使用SYBR One-Step qRT-PCR試劑盒進行qRT-PCR反應，引物序列見表1。反應體系（20 μL）：2×StarScript Ⅱ Green One Step qRT-PCR Buffer 10 μL，StarScript Ⅱ One Step Enzyme Mix 2.0 μL，ROX Reference Dy 0.4 μL，RNA模板 2.0 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH₂O 4.8 μL。反應條件：反轉錄 50 ℃ 10 min，預變性94 ℃ 2 min；變性94 ℃ 15 s，退火（NLRP3 57 ℃、IL-1β 60 ℃、Caspase1 55 ℃、GSDMD 58 ℃） 15 s，延伸70 ℃ 30 s，共35個循環。以GAPDH為內參，采用2^-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。

1.4 Western blot法檢測蛻膜組織中NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD蛋白表達水平 取部分冷凍的蛻膜組織，冰上研碎，加預冷的RIPA裂解液，12 000 r/min離心10 min，BCA試劑盒檢測上清液蛋白濃度。計算上樣體積，各樣品取40 μg蛋白，沸水浴變性，上樣進行SDS-PAGE電泳，使用PVDF膜進行常規轉膜操作，用5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，加入NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD、GAPDH一抗（均1∶1 000）4 ℃過夜，次日PBS沖洗PVDF膜，加羊抗兔二抗（1∶2 000）孵育1 h，避光下滴加ECL液發光顯色，凝膠成像系統拍攝圖像，以GAPDH蛋白為內參蛋白，Image J軟件分析條帶灰度。

1.5 TUNEL法檢測蛻膜組織中細胞焦亡情況 石蠟包埋的蛻膜組織切片（4 μm），使用TUNEL試劑盒進行染色操作（一抗為Caspase1抗體）。每位患者取一張切片于光鏡下觀察蛻膜組織染色結果，細胞核中有棕黃色顆粒者為焦亡細胞，每張切片隨機抽取5個不重疊視野，統計焦亡細胞百分比，即焦亡率。

1.6 統計學方法 采用SPSS 24.0、GraphPad 7.0統計軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料采用x±s表示，2組間比較行獨立樣本t檢驗。相關分析用Pearson相關系數。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD mRNA相對表達水平比較 與對照組比較，研究組NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD mRNA相對表達水平均升高（P＜0.01），見表2。

2.2 2組NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD蛋白相對表達水平比較 與對照組比較，研究組NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD蛋白相對表達水平均升高（P＜0.01），見圖1、表3。

2.3 2組患者蛻膜組織中細胞焦亡率比較 研究組蛻膜組織中細胞焦亡率（18.94%±4.08%）高于對照組（5.26%±1.33%），差異有統計學意義（t=31.907，P＜0.01），見圖2。

2.4 研究組患者蛻膜組織中細胞焦亡率與NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD蛋白表達的相關性 研究組患者蛻膜組織中細胞焦亡率與NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD蛋白表達水平均呈正相關（r分別為0.429、0.474、0.498、0.540，P＜0.05）。

3 討論

近年來，我國不孕不育患者的數量呈增長趨勢，且一些有孕育打算的中、高年齡群體受孕概率較低，故輔助妊娠措施越來越受到重視［8］。IVF/ICSI能大大提高受孕率，縮短待孕時間，但IVF/ICSI助孕妊娠12周內容易發生早期流產［9］。因此，研究IVF/ICSI助孕妊娠后發生早期流產的機制具有重要意義。

蛻膜組織在妊娠過程中發揮重要作用，可逐漸發育為胎盤，成為母體-胎兒之間的紐帶，可負責氧氣、營養物質、代謝廢物等的交換，而蛻膜組織由子宮內膜間質增殖、再分化形成，在胚胎著床、妊娠的建立與維持、分娩發動過程中均起重要作用。趙亞民等［10］認為，miR-575可能通過促進蛻膜細胞凋亡及炎癥反應，參與自然流產反復發生過程。本研究結果顯示，IVF/ICSI助孕妊娠后早期流產患者蛻膜組織中細胞焦亡率較人工流產患者顯著升高，表明蛻膜組織中細胞過多焦亡可能是患者IVF/ICSI助孕妊娠后早期發生流產的重要原因，探究更多關于蛻膜組織中細胞焦亡的機制具有重要意義。

焦亡嚴重依賴于炎癥反應，發生時會導致細胞脹破、內容物外泄，引發更多的炎癥反應及細胞焦亡［11］。Landi等［12］研究顯示，妊娠早期失調的促炎過程可能在復發緩解型多發性硬化癥女性流產中發揮重要作用。Bas等［13］研究表明，白細胞計數、血小板計數、中性粒細胞計數與淋巴細胞計算的比值等全血炎癥標志物可用于妊娠自然流產的風險評估。Suttorp等［14］研究發現，感染性炎癥、非感染性炎癥均可導致胎盤功能障礙及妊娠并發癥發生，增加懷孕小鼠流產的發生率。經典的焦亡途徑依賴于Caspase1誘導的炎癥反應，當外源性、內源性刺激信號經由炎癥小體NLRP3激活Caspase1后，打孔蛋白GSDMD介導細胞膜孔道的形成，使得細胞腫脹破裂，胞內物質流出，刺激IL-1β等炎性因子大量合成并釋放，加重炎癥反應，最終誘導細胞焦亡發生［15］。秦志平等［16］研究亦顯示，稽留流產患者滋養細胞細胞質中GSDMD、NLRP3、Caspase-1、IL-1β高于正常早孕女性。本研究結果顯示，與人工流產患者相比，IVF/ICSI助孕妊娠后早期流產患者蛻膜組織中NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD mRNA及蛋白表達水平均升高，再次證實了IVF/ICSI助孕妊娠后早期流產患者蛻膜組織中發生了大量的細胞焦亡。肖文霞等［17］研究發現，蛻膜組織細胞焦亡與稽留流產具有相關性。本研究結果顯示，研究組患者蛻膜組織中細胞焦亡率與NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD蛋白表達水平均呈正相關，表明IVF/ICSI助孕妊娠后早期流產患者蛻膜組織中細胞死亡方式與細胞焦亡有關，蛻膜組織中細胞大量焦亡可能是導致患者IVF/ICSI助孕妊娠后早期發生流產的重要原因之一。

綜上所述，IVF/ICSI助孕妊娠后早期流產患者蛻膜組織中焦亡相關因子NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD的mRNA及蛋白表達水平均明顯上調，可能參與蛻膜組織細胞焦亡發生，進而導致患者流產。

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（2022-06-21收稿 2022-09-28修回）

（本文編輯 陸榮展）