膀胱癌患者的血清miR-1305和miR-145表達(dá)水平及其臨床意義▲

何 偉 胥 豐 王鐳播 岑壯頂

(北京積水潭醫(yī)院貴州醫(yī)院外科,貴州省貴陽(yáng)市 550014)

膀胱癌是常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,2020年全球約有57萬(wàn)例膀胱癌新發(fā)病例,死亡病例約21萬(wàn)例[1]。目前膀胱癌的治療手段包括膀胱腫瘤電切術(shù)或根治術(shù)、化療、放療等,但是該病復(fù)發(fā)率高,容易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及局部浸潤(rùn)[2]。膀胱癌患者的病情發(fā)展比較隱匿,雖然早期可表現(xiàn)出血尿等臨床癥狀,但疾病的早期診斷水平總體較低[3]。因此,探索膀胱癌的新型生物標(biāo)志物及有效治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。miRNA已被證實(shí)與多種人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。miRNA在血清或血漿中具有較高的穩(wěn)定性,是診斷腫瘤的潛在新型標(biāo)志物。miR-1305在調(diào)節(jié)干細(xì)胞增殖、分化和遷移中發(fā)揮重要作用[5]。研究表明,過(guò)表達(dá)miR-1305可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6]。miR-145是近年來(lái)研究較多的與腫瘤相關(guān)的miRNA,其在多種腫瘤中具有抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,可作為抑癌基因參與癌癥發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程[7]。但是否可以通過(guò)血清miR-1305、miR-145表達(dá)水平來(lái)預(yù)測(cè)膀胱癌的發(fā)生及判斷預(yù)后,目前的相關(guān)研究較少。因此,本研究主要分析膀胱癌患者的血清miR-1305、miR-145表達(dá)水平及其與患者臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系,以及其在膀胱癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月至2019年1月在我院住院治療的83例膀胱癌患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)術(shù)后病理檢查結(jié)果符合膀胱癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[8];(2)首次確診;(3)術(shù)前未接受手術(shù)、化療、放療;(4)患者及家屬對(duì)本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并尿路感染、尿路結(jié)石等泌尿系統(tǒng)疾病者;(2)伴有免疫性疾病或血液系統(tǒng)疾病者;(3)拒絕隨訪者;(4)伴有心、肝、腎功能嚴(yán)重?fù)p傷者;(5)一般資料不完整者。83例膀胱癌患者中,男性52例、女性31例;年齡38～80(62.41±6.23)歲,其中<60歲者42例,≥60歲者41例;腫瘤類型為肌層浸潤(rùn)型32例,非肌層浸潤(rùn)型51例;腫瘤位置位于膀胱體28例,膀胱底35例,三角區(qū)20例;腫瘤直徑≤3 cm者46例,>3 cm者37例;腫瘤浸潤(rùn)未侵及漿膜層(淺層)38例,侵及漿膜層(深層)45例;腫瘤分期為Ⅰ+Ⅱ期38例,Ⅲ+Ⅳ期45例;發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例,未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例;腫瘤高/中分化程度46例,腫瘤低分化程度37例。選取同期于本院進(jìn)行體檢的83例健康志愿者作為對(duì)照組,其中男性51例、女性32例,年齡38～80(62.61±6.33)歲。兩組研究對(duì)象的性別分布及年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 血清miR-1305、miR-145表達(dá)水平的檢測(cè) 于患者入院后第2天清晨、健康志愿者體檢當(dāng)天,采集其空腹靜脈血3 mL,經(jīng)4 ℃、3 000 r/min離心10 min后分離血清,于-80 ℃保存。按照RNA提取試劑盒(北京盒子生工科技有限公司,貨號(hào):AKNA001-1)操作說(shuō)明書(shū),采用TRIzol法提取血清總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(QIAGEN公司,貨號(hào):205311)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后,以U6為內(nèi)參基因,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司,型號(hào):ABI 7500)進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系共20 μL,包括2×SYBR qPCR Green Master Mix(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào):SR1110)10 μL、PCR上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL、cDNA(50 ng/μL)2 μL,加ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性 30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸10 min。U6上游引物為5′-GCTGGACTCTAGGGTGCAAG-3′,下游引物為5′-GAGCATACCAGGTGGTAGTAG-3′;miR-1305上游引物為5′-ACAGGCCGGGACAAGTGCAATA-3′,下游引物為5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′;miR-145上游引物為5′-GTCCAGTTTTCCCAGG-3′,下游引物為5′-GAGCAGGCTGGAGAA-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-1305、miR-145的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 隨訪 術(shù)后對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪,每月至少進(jìn)行1次電話或微信隨訪,半年至少進(jìn)行兩次門診隨訪,隨訪時(shí)間為3年。隨訪截止時(shí)間為2022年1月30日或患者出現(xiàn)因膀胱癌死亡時(shí)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);計(jì)量資料以(x±s)表示,組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析血清miR-1305、miR-145表達(dá)水平診斷膀胱癌的臨床價(jià)值,采用Z檢驗(yàn)比較不同指標(biāo)之間的曲線下面積(area under the curve,AUC);采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析,采有l(wèi)og-rank檢驗(yàn)比較生存曲線之間的差異;采用多因素COX回歸模型分析膀胱癌患者預(yù)后的影響因素。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組研究對(duì)象血清miR-1305、miR-145表達(dá)水平的比較 膀胱癌組的血清miR-1305、miR-145表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 兩組研究對(duì)象血清miR-1305和miR-145相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

2.2 膀胱癌患者血清miR-1305、miR-145表達(dá)水平與其臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)膀胱癌患者血清miR-1305、miR-145表達(dá)水平的中位值(分別為0.45、0.50),將其分為高表達(dá)患者(n=41)和低表達(dá)患者(n=42)。TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度為低分化的膀胱癌患者血清miR-1305、miR-145高表達(dá)的比例均分別低于TNM分期為Ⅰ+Ⅱ 期、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度為中/高分化者,且腫瘤直徑>3cm的膀胱癌患者血清miR-1305高表達(dá)的比例低于腫瘤直徑≤3cm者(P<0.05),見(jiàn)表2。

2.3 血清miR-1305、miR-145表達(dá)水平與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系 血清miR-1305高表達(dá)、低表達(dá)患者的3年生存率分別為87.80%、69.05%,血清miR-145高表達(dá)、低表達(dá)患者的3年生存率分別為90.24%、66.67%,血清miR-1305、miR-145高表達(dá)患者的3年生存率分別高于血清miR-1305、miR-145低表達(dá)患者(χ2=4.628,P=0.031;χ2=6.675,P=0.010),見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 不同血清miR-1305表達(dá)水平膀胱癌患者的生存曲線圖

圖2 不同血清miR-145表達(dá)水平膀胱癌患者的生存曲線圖

2.4 膀胱癌患者預(yù)后影響因素的多因素COX回歸分析 以膀胱癌患者術(shù)后3年內(nèi)的預(yù)后為因變量(死亡=1,生存=0),以TNM分期(“Ⅰ+Ⅱ期”賦值“0”,“Ⅲ+Ⅳ期”賦值“1”)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(“否”賦值“0”,“是”賦值“1”)、腫瘤分化程度(“中/高分化”賦值“0”,“低分化”賦值“1”)、血清miR-1305表達(dá)水平(“miR-1305低表達(dá)”賦值“0”,“miR-1305高表達(dá)”賦值“1”)、血清miR-145表達(dá)水平(“miR-145低表達(dá)”賦值“0”,“miR-145高表達(dá)”賦值“1”)為自變量,進(jìn)行多因素COX回歸分析。結(jié)果顯示,TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是膀胱癌患者死亡的危險(xiǎn)因素,血清miR-1305高表達(dá)、miR-145高表達(dá)是其保護(hù)因素(P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 多因素COX回歸分析結(jié)果

2.5 血清miR-1305、miR-145表達(dá)水平對(duì)膀胱癌的診斷價(jià)值 血清miR-1305表達(dá)水平診斷膀胱癌的AUC為0.779,敏感度為93.98%,特異度為60.24%,最佳截?cái)嘀禐?.61;血清miR-145表達(dá)水平診斷膀胱癌的AUC為0.783,敏感度為68.67%,特異度為79.52%,最佳截?cái)嘀禐?.63;二者聯(lián)合診斷(并聯(lián))的AUC為0.874,敏感度為90.36%,特異度為74.70%。二者聯(lián)合診斷的AUC大于血清miR-1305、miR-145表達(dá)水平單獨(dú)診斷(Z=2.810,P=0.005;Z=2.686,P=0.007),見(jiàn)圖3。

圖3 血清miR-1305、miR-145表達(dá)水平單獨(dú)和聯(lián)合診斷膀胱癌的ROC曲線圖

3 討 論

膀胱癌的主要類型為肌層浸潤(rùn)型膀胱癌和非肌層浸潤(rùn)型膀胱癌,其中非肌層浸潤(rùn)型膀胱癌患者容易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,預(yù)后往往不佳[9]。隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步,目前治療膀胱癌的手段可在一定程度上延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間,但是由于膀胱癌的臨床癥狀較為隱匿,早期診斷的難度較大。診斷膀胱癌的“金標(biāo)準(zhǔn)”為膀胱鏡檢聯(lián)合病理檢查,但是其侵入性給患者帶來(lái)極大的痛苦與不適[10]。實(shí)驗(yàn)室尿檢具有較高的特異度,但是其靈敏度極低,容易出現(xiàn)漏診[11]。因此,尋找較高效能的血清標(biāo)志物對(duì)膀胱癌的早期診斷及預(yù)后改善具有重要意義。

miRNA是一類保守非編碼RNA,其通過(guò)調(diào)控下游靶基因廣泛參與多種生物過(guò)程,包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育及應(yīng)激反應(yīng)等[12]。研究表明,miRNA可作為腫瘤抑制因子或促癌因子在調(diào)控癌癥進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[13]。例如,有學(xué)者指出,miR-1305在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)下調(diào),miR-1305表達(dá)降低與患者預(yù)后不良顯著相關(guān),其通過(guò)靶向鼠雙微體2基因來(lái)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖[6]。He等[14]報(bào)告,宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-1305水平降低,其通過(guò)抑制淋巴特異性解旋酶抗體來(lái)抑制宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Su等[15]發(fā)現(xiàn),環(huán)狀RNA circRIP2可對(duì)miR-1305發(fā)揮海綿作用,從而使膀胱癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2水平升高,并激活磷酸化Smad3,進(jìn)而加速膀胱癌進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示,膀胱癌患者的血清miR-1305表達(dá)水平低于健康志愿者(P<0.05),這可能是因?yàn)閙iR-1305表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的表達(dá),使Smad3信號(hào)通路被激活,從而發(fā)揮促癌作用[15]。本研究結(jié)果還顯示,TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度為低分化、腫瘤直徑>3 cm的膀胱癌患者血清miR-1305高表達(dá)的比例分別低于TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度為中/高分化、腫瘤直徑≤3 cm者,且血清miR-1305高表達(dá)的膀胱癌患者3年生存率高于血清miR-1305低表達(dá)患者,血清miR-1305高表達(dá)是膀胱癌患者死亡的保護(hù)因素(P<0.05)。以上結(jié)果提示miR-1305在膀胱癌患者體內(nèi)發(fā)揮抑癌作用,其表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)癌癥進(jìn)展,導(dǎo)致患者預(yù)后不良。

Michael等[16]首次報(bào)告miR-145在結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)水平下調(diào),參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。隨后,不斷有學(xué)者報(bào)告miR-145與其他癌癥的關(guān)系。例如,Su等[17]發(fā)現(xiàn),miR-145在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)水平下調(diào),其通過(guò)靶向RAR相關(guān)孤兒受體抑制食管癌細(xì)胞的增殖與遷移。王敬等[18]發(fā)現(xiàn),miR-145可通過(guò)靶向葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1來(lái)調(diào)節(jié)蛋白激酶B信號(hào)通路,從而抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移與增殖。本研究結(jié)果顯示,膀胱癌患者的血清miR-145表達(dá)水平低于健康志愿者(P<0.05),這可能是因?yàn)閙iR-145可通過(guò)靶向作用下游基因來(lái)調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路,從而抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移。本研究結(jié)果還顯示,TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度為低分化的膀胱癌患者血清miR-145高表達(dá)的比例分別低于TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度為中/高分化者,且血清miR-145高表達(dá)的膀胱癌患者3年生存率高于血清miR-145低表達(dá)患者,血清miR-145高表達(dá)是膀胱癌患者死亡的保護(hù)因素(P<0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明miR-145也在膀胱癌患者體內(nèi)發(fā)揮抑癌作用,且與患者的預(yù)后密切相關(guān)。

此外,本研究進(jìn)一步分析了血清miR-1305、miR-145表達(dá)水平對(duì)膀胱癌的診斷價(jià)值,結(jié)果顯示二者對(duì)膀胱癌均有一定的診斷價(jià)值,且二者聯(lián)合診斷的效能優(yōu)于二者單獨(dú)診斷。由此可見(jiàn),miR-1305、miR-145有望成為診斷膀胱癌的血清學(xué)標(biāo)志物。

綜上所述,膀胱癌患者血清中的miR-1305、miR-145表達(dá)水平下調(diào),與患者臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系密切,二者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)膀胱癌具有較高的診斷價(jià)值,有望成為診斷膀胱癌的新型血清學(xué)標(biāo)志物。但二者具體的作用機(jī)制及相互之間存在的聯(lián)系有待進(jìn)一步研究。此外,本研究未分析治療方案對(duì)患者預(yù)后造成的影響,在后續(xù)研究中可將其納入研究?jī)?nèi)容以進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)論。