分光光度法測(cè)定海水中葉綠素a 的方法研究

石文靜 施巍 王寧 張雷

（遼寧省大連生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，遼寧 大連 116000）

1 引言

水體富營養(yǎng)化（eutrophication）是指在人類活動(dòng)的影響下，生物所需的氮磷等營養(yǎng)物質(zhì)大量進(jìn)入湖泊、河湖、海灣等緩流水體，引起藻類及其他浮游生物迅速繁殖，導(dǎo)致水體溶解氧含量下降，引起水質(zhì)惡化，從而造成魚類及其他生物大量死亡的現(xiàn)象。在自然條件下，也會(huì)發(fā)生湖泊從貧營養(yǎng)狀態(tài)逐步過渡到富營養(yǎng)狀態(tài)的現(xiàn)象，一般自然界中的這種過程通常非常緩慢。但是隨著工業(yè)的發(fā)展，人為排放的含有各類營養(yǎng)物質(zhì)的工業(yè)廢水以及生活污水引起的水體富營養(yǎng)化卻可以在極短時(shí)間內(nèi)發(fā)生。當(dāng)水體出現(xiàn)富營養(yǎng)化時(shí)，生物表現(xiàn)形式為藻類大量繁殖，從而形成水華或赤潮現(xiàn)象（通常淡水富營養(yǎng)化稱為水華，海水富營養(yǎng)化則稱為赤潮）。通常來講，葉綠素a 是評(píng)價(jià)水體富營養(yǎng)化的一個(gè)重要參數(shù)，所以葉綠素a 的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)以及分析方法就非常重要。根據(jù)GB 17378.7—2007《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》［1］規(guī)定，我國海水葉綠素a 的監(jiān)測(cè)方法分為熒光分光光度法和分光光度法兩種，但現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中這兩種方法都沒明確檢出限、精密度和準(zhǔn)確度等方法特征性指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)室查閱多篇相關(guān)文獻(xiàn)并沒有獲得海水監(jiān)測(cè)中相關(guān)數(shù)據(jù)，但在實(shí)際工作中以及填報(bào)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)時(shí)卻經(jīng)常會(huì)要求填報(bào)方法檢出限之類的數(shù)據(jù)，所以本文以GB 17378.7—2007《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》、HJ 168—2020《環(huán)境監(jiān)測(cè)分析方法標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)導(dǎo)則》［2］、HJ 897—2017《水質(zhì)葉綠素a 的測(cè)定分光光度法》［3］和《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》（第四版）［4］為依據(jù)，參考地表水中葉綠素a的方法研究等文獻(xiàn)材料［5］，通過試驗(yàn)確立分光光度法分析海水中葉綠素a 的實(shí)驗(yàn)室檢出限、精密度和準(zhǔn)確度等特征性指標(biāo)數(shù)據(jù)，以方便日常工作數(shù)據(jù)填報(bào)，并為其他實(shí)驗(yàn)室分析人員提供參考。

2 材料與方法

實(shí)驗(yàn)室參照GB 17378.7—2007《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》中分光光度法對(duì)實(shí)驗(yàn)室分析條件的要求以及HJ 168—2020《環(huán)境監(jiān)測(cè)分析方法標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)導(dǎo)則》中對(duì)分析項(xiàng)目檢出限、準(zhǔn)確度以及精密度的相關(guān)規(guī)定，開展針對(duì)海水中葉綠素a 的分析檢測(cè)，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果并參照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》（第四版）以及HJ 168—2020《環(huán)境監(jiān)測(cè)分析方法標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)導(dǎo)則》中對(duì)分析項(xiàng)目檢出限、準(zhǔn)確度以及精密度的相關(guān)計(jì)算方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算并匯總。

2.1 儀器與試劑

參照GB 17378.7—2007《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》中分光光度法監(jiān)測(cè)葉綠素a 的實(shí)驗(yàn)室分析條件。

儀器：分光光度計(jì)；0.45 μm 玻璃纖維濾膜；具塞離心管。

試劑：葉綠素a 標(biāo)準(zhǔn)樣品（編號(hào)KCG6922）；90%丙酮溶液；碳酸鎂懸浮液（10 g/L）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

按照GB 17378.7—2007《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》中分光光度法監(jiān)測(cè)葉綠素a 的實(shí)驗(yàn)室分析條件。

2.2.1 樣品制備

利用量筒準(zhǔn)確量取一定量海水樣品，加入3 mL碳酸鎂懸浮液，并混勻。混勻后樣品用0.45 μm 玻璃纖維濾膜過濾，過濾負(fù)壓不應(yīng)超過50 kPa。

2.2.2 樣品提取

將樣品制備中過濾樣品后得到的玻璃纖維濾膜放入具塞離心管中，迅速加入10 mL 丙酮溶液并搖蕩，隨后放冰箱儲(chǔ)存室中儲(chǔ)存14～24 h 后取出離心提取，選擇離心機(jī)離心速度3 000～4 000 r/min、離心時(shí)間10 min。

2.2.3 樣品測(cè)定

取離心后的上清液于1 cm 比色皿中，利用分光光度計(jì)對(duì)上清液進(jìn)行掃描分析，分析過程中利用空白丙酮溶液作參比溶液，分別記錄分光光度計(jì)750，664，647，630 nm 4 個(gè)波長處所測(cè)得的吸光值。需要注意的是，當(dāng)分光光度計(jì)波長在750 nm 處，1 cm比色皿吸光度超過0.005 時(shí)，參與分析的提取液需要重新離心再進(jìn)行分光光度比色分析。

3 結(jié)果與分析

參照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》（第四版）中相關(guān)規(guī)定以及HJ 168—2020《環(huán)境監(jiān)測(cè)分析方法標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)導(dǎo)則》中對(duì)分析項(xiàng)目檢出限、準(zhǔn)確度以及精密度的相關(guān)規(guī)定，本試驗(yàn)分別對(duì)海水中葉綠素a 進(jìn)行關(guān)于檢出限、準(zhǔn)確度以及精密度等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)統(tǒng)計(jì)計(jì)算。

3.1 檢出限

對(duì)濃度為0.1 mg/L 的海水葉綠素a 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算7 次平均測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差，按照下面公式計(jì)算海水葉綠素a 的方法檢出限：

式中，MDL 為方法檢出限；n 為樣品的平行測(cè)定次數(shù)；t 為自由度為n-1、置信度為99%時(shí)的t 分布（單側(cè)，n=7 時(shí)，t=3.143）；S 為n 次平行測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差。測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 檢出限測(cè)定結(jié)果mg/L

由表1 中7 個(gè)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算得出檢出限為0.018 mg/L，從而可以計(jì)算出：當(dāng)實(shí)驗(yàn)室丙酮使用液體積為10 mL、采樣體積為1 000 mL 時(shí)，海水中葉綠素a 的實(shí)驗(yàn)室檢出限為0.18 μg/L。

3.2 準(zhǔn)確度

實(shí)驗(yàn)室采取加標(biāo)回收率的方法來考察分光光度法檢測(cè)海水中葉綠素a 的方法準(zhǔn)確性。采取對(duì)2 個(gè)濃度的實(shí)際樣品加標(biāo)的方法來考察方法的準(zhǔn)確度，加標(biāo)方法為對(duì)實(shí)際海水樣品抽濾后加入葉綠素a 標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照GB 17378.7—2007《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》中分光光度法對(duì)樣品進(jìn)行分析，分析結(jié)果見表2。由表2 可以看出，2 個(gè)濃度的海水實(shí)際樣品加標(biāo)回收率分別為85.4%和82.7%。

表2 準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果

3.3 精密度

對(duì)不同濃度的海水實(shí)際樣品進(jìn)行平行測(cè)定6次，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察分光光度法檢測(cè)海水中葉綠素a 的方法精密度，實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果見表3。由表3 可以看出，分光光度法檢測(cè)海水中葉綠素a 的方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%～4.4%。

表3 準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果

4 結(jié)果與討論

由以上實(shí)驗(yàn)可以得出結(jié)論，利用分光光度法分析海水中葉綠素a 時(shí)，當(dāng)丙酮使用液體積為10 mL、海水采樣體積為1 000 mL 時(shí)，本實(shí)驗(yàn)利用分光光度法進(jìn)行的海水中葉綠素a 分析的方法檢出限為0.18 μg/L，海水中葉綠素a 實(shí)際樣品加標(biāo)回收率為85.4%和82.7%，實(shí)驗(yàn)室精密度為0.8%～4.4%。

總結(jié)本實(shí)驗(yàn)過程的注意事項(xiàng)和關(guān)鍵點(diǎn)為：（1）海水樣品在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室葉綠素a 分析之前必須搖勻再進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)室操作步驟；（2）如果實(shí)驗(yàn)過程中當(dāng)分光光度計(jì)波長在750 nm 處，1 cm 比色皿的吸光度超過0.005 時(shí)，參與分析的葉綠素a 提取液應(yīng)重新離心再參與分析檢測(cè)；（3）由于葉綠素a 具有對(duì)光敏感的特性，所以實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行海水中葉綠素a 實(shí)驗(yàn)的全過程都應(yīng)該在微光照條件下操作，并且實(shí)驗(yàn)中所使用的標(biāo)準(zhǔn)溶液要嚴(yán)格避光保存。