檢測時間和保存方式對飲用水源水中糞大腸菌群測定的影響

楊紅力 劉晶

（北京中職安康科技有限公司環境實驗室，北京 101399）

1 引言

糞大腸菌群（Fecal Coliforms）作為一種糞便污染的指示微生物［1］，具有污染水源從而導致人體腸道疾病的風險［2］，是飲用水源水生物安全中一項重要的檢測指標［3］。由于糞大腸菌群的微生物學屬性，其生長和繁殖符合微生物生長曲線，即大致經歷遲緩期、對數生長期、穩定生長期、衰亡期4 個生長時期［4］，故其性質和一般的理化指標完全不同［5］，對樣品檢測時間和保存條件的要求比較特殊［6］。對于這類樣品，一般的原則是冷藏保存，快速檢測。現行的世界各地的標準要求也是這樣規定的［7］，如中國的要求是采樣后2 h 內檢測，或0～10 ℃保存，6 h 內檢測［8-10］；美國是采樣后0～10 ℃保存，8 h 內檢測［11］；歐盟是采樣后5±3 ℃保存，8 h 內檢測［12］；世界衛生組織則要求采樣后2 h 內檢測，或4～10 ℃保存，24 h內檢測［13］。總體上都遵循冷藏保存、快速檢測的原則。但實際工作中因長距離運輸，如異地采樣，微生物樣品在檢測之前已經保存了較長時間［14-15］，使最終檢測結果的有效性難以保證［16-17］，因此對微生物樣品檢測時間和保存時間的研究非常必要。

目前對微生物樣品檢測時間和保存方式的研究多集中在最長保存時間和不同溫度點的驗證方面［18-19］，對季節因素、試驗結果有效性和不同檢測方法比較的研究鮮有報道。糞大腸菌群現行的檢測方法有發酵法、濾膜法、酶底物法、紙片法、聚合酶鏈式技術等，其中前3 種是比較常用的方法［20-22］。本研究擬在現行標準要求的條件下，以水源水中糞大腸菌群為指標，選取上述較常用的3 種方法，在不同季節、不同保存條件、不同時間段內檢測目標微生物，最后參照GB 3838—2002《地表水環境質量標準》［22］，以檢測數據的有效性, 針對不同標準中對微生物水樣檢測時間和保存條件規定的合理性進行探討。

2 試驗部分

2.1 儀器與試劑

儀器：車載冷藏箱（北京優冷，RL-350YS），無菌采樣袋（青島海博，45 cm×55 cm），高壓蒸汽滅菌器（上海三申，YX280），超凈工作臺（濟南鑫貝西，BBSSDC），生化培養箱（上海一恒，LRH-250），拍打式均質器（北京陸橋，B01），紫外燈（上海歷辰，365 nm），97 孔定量盤（愛德士，美國），程控定量封口機（愛德士，CHQC-20），乳糖蛋白胨培養基（陸橋，北京），EC肉體培養基（陸橋，北京），MFC 培養基（陸橋，北京），ONPG-MUG 培養基（Colilert，美國）。試劑：糞大腸菌群QC 試劑（愛德士，美國）。

2.2 樣品采集

分別在冬季和夏季以無菌采樣的方法采集某水源水引水渠水樣，采樣點離實驗室約20 min 車程，采樣時記錄當時氣象條件。樣品采集后分兩批保存，一批立即保存于滅過菌的車載冷藏箱內（內部溫度3 ℃），另一批保存于滅過菌的常溫樣品箱內。兩批樣品同車運送，20 min 內送至實驗室檢測。

2.3 樣品分析

按照標準方法，采用多管發酵法、濾膜法、酶底物法3 種方法，分析不同季節、不同保存方式下的樣品。第一階段間隔為每0.5 h 1 組，至6.0 h 后進入第二階段，時間間隔為每2.0 h 1 組，至10.0 h 后進入第三階段，即24.0 h 后加測1 組，共15 組。每測1 組均記錄當時水樣溫度和室溫，每組樣品測試前需經均質器拍打，保證樣品的均質性。陰性對照、陽性對照和QC 質控試驗隨各階段同步進行。

2.4 數據統計與分析

本研究采用單因素方差分析檢驗不同分析方法對檢測結果的影響，利用雙因素方差分析探討檢測時間和保存方式對檢測結果的影響，利用t 檢驗比較同一檢測時間時不同保存方式對檢測結果的影響。數據統計分析在R 軟件中進行。

3 結果與討論

3.1 不同季節糞大腸菌群生長結果

3.1.1 冬季試驗結果

樣品采集后常溫保存，2.0 h 內樣品溫度從1.5 ℃升至2.9 ℃，糞大腸菌群繁殖緩慢，從140 個/L 生長到200 個/L（發酵法），結果均符合GB 3838—2002《地表水環境質量標準》的限值要求（≤2 000 個/L），甚至24.0 h 后結果依然符合要求，說明室溫2.0 h 檢測的標準要求合理有效。冬季常溫保存條件下，不同檢測時間糞大腸菌群檢測結果見表1。

表1 冬季常溫保存條件下不同檢測時間糞大腸菌群檢測結果

樣品采集后冷藏保存，6.0 h 內樣品溫度從1.4 ℃升至3.3 ℃，糞大腸菌群繁殖仍然緩慢，從110 個/L生長到240 個/L（發酵法），結果均符合GB 3838—2002《地表水環境質量標準》的限值要求（≤2 000 個/L），甚至24.0 h 后結果依然符合要求，說明冷藏6.0～10.0 h 內檢測的標準要求合理有效。冬季冷藏保存條件下不同檢測時間糞大腸菌群檢測結果見表2。

表2 冬季冷藏保存條件下不同檢測時間糞大腸菌群檢測結果

3.1.2 夏季試驗結果

樣品采集后常溫保存，2.0 h 內樣品溫度從27.3 ℃升至28.5 ℃，糞大腸菌群快速繁殖，從540 個/L 生長到5 400 個/L（發酵法），0.5 h 檢測結果（540 個/L）和1.0 h 檢測結果（1 400 個/L）均符合GB 3838—2002《地表水環境質量標準》的限值要求（≤2 000 個/L），而1.5 h 檢測結果（2 200 個/L）和2.0 h 檢測結果（5 400 個/L）則不符合標準要求，即樣品由于保持不當和檢測滯后而致使結果超標，說明2.0 h 內檢測的標準要求在夏季不適用。10.0 h 和24.0 h 后，糞大腸菌群已經迅速繁殖。夏季常溫保存條件下不同檢測時間糞大腸菌群檢測結果見表3。

表3 夏季常溫保存條件下不同檢測時間糞大腸菌群檢測結果

樣品采集后冷藏保存，6.0 h 內樣品溫度從26.1 ℃降至6.2 ℃，糞大腸菌群正常繁殖，從520 個/L 生長到1 700 個/L（發酵法），結果均符合GB 3838—2002《地表水環境質量標準》的限值要求（≤2 000個/L），6.0 h 后糞大腸菌群則繁殖加快，至8.0 h 時結果超標，說明冷藏保存條件下6.0 h 檢測的標準要求合理有效。夏季冷藏保存條件下不同檢測時間糞大腸菌群檢測結果見表4。

表4 夏季冷藏保存條件下不同檢測時間糞大腸菌群檢測結果

3.2 3 種檢測方法對檢測結果的影響

采用單因素方差分析檢驗不同糞大腸菌群檢測方法之間的差異，結果表明，3 種檢測方法對不同季節和不同保存方法下的檢測結果的影響無統計學意義（P＞0.05），見表5。

表5 3 種檢測方法對檢測結果的影響（單因素方差分析）

3.3 不同季節檢測時間和保存溫度對糞大腸菌群檢測結果差異性分析

利用雙因素方法分析和t 檢驗分析了檢測時間與保存溫度對檢測結果的影響，具體結果如圖1。從圖1 可以看出，在冬季，隨著檢測時間的延長，糞大腸菌群檢出的數值顯著增加（P＜0.001）。總體來看，常溫保存下的糞大腸菌群檢測結果要大于冷藏保存（P＜0.05）。在夏季，取樣后0.5 h 時檢測，不同保存方式（常溫、冷藏）對糞大腸菌群檢測結果的影響無統計學意義（P＞0.05）。但取樣后1.0 h 時檢測，常溫保存樣品中糞大腸菌群的檢出數值顯著高于冷藏保存樣品（P＜0.01）。并且隨著檢測時間的延長，檢測結果在兩種保存方式之間的差異越來越大。

圖1 檢測時間和保存溫度對檢測結果的影響

4 討論

從試驗數據和統計結果可見，在冬季，無論樣品冷藏還是常溫保存，2.0 h 內檢測和10.0 h 內檢測對結果的有效性影響不大，甚至24.0 h 后檢測結果依然符合要求。說明在冬季室溫較低的情況下，保存條件（冷藏或常溫）和檢測時間（10.0 h 內）對糞大腸菌群檢測結果的影響不顯著。雖然如此，但冷藏樣品檢測結果的波動（10.0 h 內從110 個/L 生長到270 個/L）明顯小于常溫保存（10.0 h 內從140 個/L 生長到520 個/L）。對于較干凈的水樣，這種波動也許可以接受，但對于污染的水樣，則有可能不能完全反映其受污染的程度。因此，在冬季，冷藏保存同樣很有必要。

夏季，由于氣溫高，微生物繁殖旺盛，樣品常溫保存時，2.0 h 內甚至1.5 h 內糞大腸菌群已經繁殖到超出限值，而冷藏保存6.0 h 內檢測，則對結果的有效性影響不大。這說明在夏季高溫環境下，保存條件（常溫）和檢測時間對糞大腸菌群檢測結果的影響顯著，如此則“采樣后2.0 h 內檢測”的標準要求便值得再商榷。

經過分析，3 種檢測方法對檢測結果的影響無統計學意義，但從檢測結果上看，無論是冷藏還是常溫保存，發酵法的結果都比另外2 種方法偏高，濾膜法和酶底物法在數值增長上比較一致，可見相比前者，后2 種方法的數據更符合實際。

5 結論

通過對檢測數據的統計與分析，本研究主要得出以下結論：

（1）對于樣品檢測時間和保存方式，現行標準的要求值得進一步商榷，應該考慮季節的因素，如夏季采樣時，在常溫保存條件下，采樣后1.0 h 內檢測，或0～4 ℃保存6.0 h 內檢測；冬季采樣，常溫保存條件下，采樣后6.0 h 內檢測，或0～4 ℃保存10.0 h 內檢測。

（2）無論冬季還是夏季，常溫保存樣品的檢測結果均大于冷藏保存，因此，冷藏保存、迅速分析的原則應一直貫徹。

（3）就檢測方法而言，濾膜法和酶底物法更能客觀反映樣品的實際情況，且在冬季冷藏保存條件下，糞大腸菌群在10.0 h 內的結果均合理有效，對解決樣品的長距離運輸問題也具有現實意義。