銀杏二萜內酯葡胺對阿爾茨海默病大鼠學習記憶障礙的改善作用

王 穎，王 強，蔣珍秀，陳 軍，雒 彧

（1.蘭州大學第一醫院神經內科，甘肅 蘭州 730000； 2.蘭州大學基礎醫學院病理生理學研究所，甘肅 蘭州 730000）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD） 又稱老年癡呆，是一種最常見的老年慢性神經退行性疾病，65 歲以上人群發病率約11%，85 歲則達到了32%［1］，患者晚期喪失生活自理能力，給其親屬和家庭帶來嚴重的經濟負擔，影響社會發展［2］。目前，仍然沒有合適的臨床藥物能防治AD，現有的也只能延緩發病。作為多病因神經退行性疾病，AD 的治療具有多靶點性［3-4］。

銀杏葉為銀杏科植物銀杏的葉，有斂肺氣、平喘咳功效，用于治療心悸怔忡、肺虛咳喘。現代藥理研究證明，銀杏提取物具有神經保護作用，對學習記憶障礙和老年癡呆癥具有一定的防治作用。銀杏內酯是銀杏葉提取物的主要活性成分，銀杏二萜內酯葡胺注射液主要成分為銀杏內酯，由銀杏內酯 A （35%）、B （60%）、C （2%）、K（2%） 等二萜內酯組成［5］。已有研究表明，銀杏二萜內酯葡胺能改善缺血再灌注大鼠腦缺血引起的行為缺陷，降低谷氨酸、天冬氨酸等興奮性氨基酸水平，增加γ-氨基丁酸等抑制性神經遞質的釋放，并通過calpain 通路抑制神經細胞凋亡［5-8］。銀杏二萜內酯葡胺能激活PI3K/Akt/Nrf2 信號通路，發揮抗氧化和保護神經細胞的作用［9-10］。課題組前期研究表明，銀杏二萜內酯葡胺能減輕老年小鼠腦內的炎癥反應，增強自然衰老小鼠學習記憶功能［11］。但銀杏二萜內酯葡胺對AD 影響的研究較少，本研究通過建立AD 大鼠模型，探討銀杏二萜內酯葡胺對AD 大鼠認知功能障礙的影響，并對其相關分子機制作進一步研究。

1 材料

1.1 動物 清潔級SD 大鼠，3 月齡，雌雄各半，體質量230～270 g，由蘭州大學實驗動物中心提供［實驗動物生產許可證號SCXK （甘） 2018-0002］，飼養于溫度20～24 ℃、自然光照的實驗環境，自由進食、飲水。本研究涉及的動物實驗操作均遵守蘭州大學實驗動物飼養和使用規范。

1.2 試劑與藥物 銀杏二萜內酯葡胺注射液 ［批號181005，5 mL （25 mg） /支，江蘇康緣藥業股份有限公司］。Aβ1-42（批號171596，美國Sigma 公司）； 兔單克隆抗體NMDA 受體2B （NR2B）、兔單克隆抗體NMDA 受體2Bphospho S1248 （p-NR2B）、鼠單克隆抗體p44/p42 MAPK（ERK1/2）、兔多克隆抗體p44/p42 MAPK- Thr202/Tyr204（p-ERK1/2） （貨號145445、5355S、4696S、9101S，美國Cell Signaling Technology 公司）； 鼠單克隆抗體鈣調蛋白依賴蛋白激酶（calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）、兔多克隆抗體CaMKⅡ-phospho T286 （p-CaMK Ⅱ）、兔多克隆抗體cAMP 反應結合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）、兔單克隆抗體CREB-phospho S133（p-CREB）、兔多克隆抗體PSD95、兔單克隆抗體腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、兔多克隆抗體TrkB、兔單克隆抗體TrkB-phospho Y705 （p-TrkB）、鼠單克隆抗體β-actin （貨號ab22609、ab32678、ab31387、ab32096、ab18258、ab108319、ab18987、ab229908、ab8226，英國Abcam 公司）； IRDyeTM（800CW）染料標記的羊抗鼠/兔二抗（美國LI-COR 公司）。

1.3 儀器 Odyssey 近紅外雙色激光成像系統（美國LICOR 公司）； WM-100 型水迷宮視頻分析系統（成都泰盟軟件有限公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 將大鼠（雌雄各半） 隨機分為假手術組、模型組和銀杏二萜內酯葡胺低、中、高劑量組，每組8 只。假手術組行腦立體定位注射手術，但不注射任何藥物，其余各組大鼠側腦室注射Aβ1-42（5 nmol/L） 建立AD 模型。造模后第2 天，銀杏二萜內酯葡胺低、中、高劑量組大鼠分別尾靜脈注射1.5、3.0、6.0 mg/kg 銀杏二萜內酯葡胺，假手術組和模型組大鼠尾靜脈注射等量生理鹽水，連續4 周。給藥結束后進行Morris 水迷宮實驗，第1～6 天為學習能力檢測，第7 天為記憶能力檢測。實驗結束后處死大鼠，分離腦組織海馬體。

2.2 腦立體定位注射Aβ1-42大鼠腹腔注射6% 水合氯醛（30 mg/kg） 進行麻醉，仰臥位固定在腦立體定位儀上，剃去頭部毛發并進行消毒，縱向切開皮膚暴露前囟顱骨，根據大鼠立體定位圖譜的側腦室坐標點（前囟后1.4 mm、矢狀線旁左側1.5 mm、深4 mm） 進行注射，注射速度0.2 μL/min，注射完畢后留針5 min，再緩慢移出注射器，縫合頭皮并消毒，將大鼠從腦立體定位儀上取下，放回飼養籠中待蘇醒。

2.3 Morris 水迷宮實驗 參考Morris 等［12］報道方法設置水迷宮圓柱形水箱直徑1.6 m，水溫23～25 ℃，測試平臺固定于第三象限內水面下2.0 cm。第1～6 天進行定位航行實驗，每天在固定時間訓練4 次，在每個象限的固定點將大鼠面向水池壁放入水箱中，60 s 內讓其自由游動并尋找隱藏的平臺，記錄找到平臺時間（逃避潛伏期），并讓其在平臺上停留休息20 s； 如果60 s 內找不到平臺（逃避潛伏期記為60 s），則由實驗人員將其引導到平臺上并停留休息20 s。第7 天進行空間探索實驗，撤除平臺，將大鼠于第一象限放入水池中，在60 s 內使用視頻跟蹤系統軟件描記其游動路徑軌跡圖，記錄穿越平臺次數、在目標象限停留時間、游程比例。

2.4 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達 將大鼠海馬體于冰浴條件下使用電動勻漿機進行勻漿，加入組織裂解液提取總蛋白，12 000 r/min 離心10 min，收集上清液，BCA 法測定樣品蛋白濃度，于-80 ℃保存備用。取部分蛋白樣本，加入上樣緩沖液煮沸10 min 變性。蛋白樣本經聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉至NC 膜，加4%脫脂牛奶-TBS 溶液室溫封閉1 h，加一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后加入兔或鼠IgG 熒光二抗室溫孵育1 h，加入ECL 發光試劑，使用奧德賽掃描成像系統掃描免疫印跡條帶，檢測并記錄條帶的相對灰度值。

2.5 統計學分析 通過SPSS 16.0 軟件進行處理，數據以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準α＝0.05。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 銀杏二萜內酯葡胺對大鼠學習記憶能力的影響 由表1 可知，水迷宮定位航行實驗第2 天起，與假手術組比較，模型組大鼠逃避潛伏期延長（P＜0.01），學習能力下降；與模型組比較，銀杏二萜內酯葡胺中、高劑量組逃避潛伏期縮短（P＜0.01），學習能力增強。由表2 可知，與假手術組比較，模型組大鼠穿越平臺次數、目標象限停留時間和游程比例均降低（P＜0.01），記憶能力下降； 與模型組比較，銀杏二萜內酯葡胺中、高劑量組大鼠穿越平臺次數、目標象限停留時間和游程比例增加（P＜0.01），記憶能力增強。

表1 銀杏二萜內酯葡胺對大鼠逃避潛伏期的影響（s，±s，n＝8）

表1 銀杏二萜內酯葡胺對大鼠逃避潛伏期的影響（s，±s，n＝8）

注： 與假手術組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別第1 天第2 天第3 天第4 天第5 天第6 天假手術組56.352±3.54342.045±2.48135.534±3.05331.376±3.53523.621±4.37516.036±2.682模型組58.542±2.05456.654±2.241** 48.854±1.614** 44.582±3.402** 36.853±3.225** 33.278±5.105*銀杏二萜內酯葡胺低劑量組 56.358±2.05855.542±2.82145.357±4.68142.258±2.31236.571±2.35730.365±2.482銀杏二萜內酯葡胺中劑量組 55.245±1.65248.351±1.852＃＃40.243±2.256＃＃34.365±2.351＃＃26.358±1.251＃＃ 21.874±1.632＃＃銀杏二萜內酯葡胺高劑量組 56.851±2.02646.778±2.225＃＃41.527±3.324＃＃35.667±2.629＃＃26.278±3.244＃＃ 22.823±3.624＃＃

表2 銀杏二萜內酯葡胺對大鼠穿越平臺次數、目標象限停留時間、游程比例的影響（±s，n＝8）

表2 銀杏二萜內酯葡胺對大鼠穿越平臺次數、目標象限停留時間、游程比例的影響（±s，n＝8）

注： 與假手術組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別穿越平臺次數/次目標象限游程比例/%目標象限停留時間比例/%假手術組5.254±0.21456.654±1.51457.084±3.811模型組3.674±0.651**39.028±2.743**40.110±2.892**銀杏二萜內酯葡胺低劑量組3.852±0.25440.521±1.95441.645±1.657銀杏二萜內酯葡胺中劑量組4.580±0.361＃＃47.368±2.036＃＃49.921±2.641＃＃銀杏二萜內酯葡胺高劑量組4.636±0.547＃＃48.625±3.012＃＃50.541±3.325＃＃

3.2 銀杏二萜內酯葡胺對大鼠海馬組織NR2B、ERK1/2、CaMKⅡ、CREB 蛋白表達的影響 由圖1、表3 可知，與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織p-NR2B、p-ERK1/2、p-CaMKⅡ、p-CREB 蛋白表達降低（P＜0.01）； 與模型組比較，銀杏二萜內酯葡胺中、高劑量組大鼠海馬組織p-NR2B、p-ERK1/2、p-CaMK Ⅱ和p-CREB 蛋白表達升高（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠海馬組織NR2B、ERK1/2、CaMKⅡ、CREB 蛋白條帶

表3 銀杏二萜內酯葡胺對大鼠海馬組織NR2B、ERK1/2、CaMKⅡ、CREB 蛋白表達的影響（±s，n＝8）

表3 銀杏二萜內酯葡胺對大鼠海馬組織NR2B、ERK1/2、CaMKⅡ、CREB 蛋白表達的影響（±s，n＝8）

注： 與假手術組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別p-NR2B/NR2Bp-ERK1/2/ERK1/2p-CaMKⅡ/CaMKⅡp-CREB/CREB假手術組1.067±0.1461.004±0.0830.992±0.1331.013±0.087模型組0.618±0.029**0.624±0.022**0.665±0.026**0.651±0.015**銀杏二萜內酯葡胺低劑量組0.652±0.030**0.629±0.013**0.710±0.036**0.661±0.042**銀杏二萜內酯葡胺中劑量組0.815±0.053＃＃0.796±0.045＃＃0.902±0.030＃＃0.857±0.081＃＃銀杏二萜內酯葡胺高劑量組0.876±0.034＃＃0.883±0.064＃＃0.827±0.071＃＃0.832±0.047＃＃

3.3 銀杏二萜內酯葡胺對大鼠海馬組織PSD95、BDNF、TrkB 蛋白表達的影響 由圖2、表4 可知，與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織PSD95、BDNF、p-TrkB 蛋白表達降低（P＜0.01）； 與模型組比較，銀杏二萜內酯葡胺中、高劑量組大鼠海馬組織PSD95、BDNF 和p-TrkB 蛋白表達升高（P＜0.01）。

圖2 各組大鼠海馬組織PSD95、BDNF、TrkB 蛋白條帶

表4 銀杏二萜內酯葡胺對大鼠海馬組織PSD95、BDNF、TrkB 蛋白表達的影響（±s，n＝8）

表4 銀杏二萜內酯葡胺對大鼠海馬組織PSD95、BDNF、TrkB 蛋白表達的影響（±s，n＝8）

注： 與假手術組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別PSD95BDNFp-TrkB/TrkB假手術組1.033±0.1761.002±0.0890.998±0.114模型組0.648±0.038**0.636±0.041**0.778±0.050**銀杏二萜內酯葡胺低劑量組0.703±0.051**0.695±0.052**0.721±0.087**銀杏二萜內酯葡胺中劑量組0.961±0.053＃＃0.905±0.043＃＃0.896±0.038＃＃銀杏二萜內酯葡胺高劑量組0.970±0.077＃＃0.942±0.021＃＃0.960±0.103＃＃

4 討論

隨著我國快速進入老齡化社會，包括AD 在內的多種神經退行性疾病的發病率持續升高。海馬體位于大腦顳葉內，對于記憶、空間定位、定向發揮關鍵作用，AD 患者海馬內嗅皮層區域最先、最易出現損傷［13］。

N-甲基-D-門冬氨酸受體（NMDAR） 家族蛋白屬于谷氨酸受體，在腦組織中普遍表達，與包括學習、認知在內的大腦高級功能具有高度的相關性。NMDAR 家族蛋白NR2B 與谷氨酸相互作用，能激活CaMK Ⅱ和細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）信號通路并誘發長時程增強效應（long-term potentiation，LTP）。CaMK Ⅱ和ERK1/2 下游最重要的分子是CREB，CREB 活化（磷酸化水平增強） 也與LTP、記憶的形成相關［14-15］。研究發現在老齡動物模型和AD 動物模型中，NR2B 以及CaMK Ⅱ、ERK1/2、CREB 的活性均下降［16-18］。本研究結果顯示，銀杏二萜內酯葡胺上調了AD 大鼠海馬組織p-NR2B 表達，激活了下游CaMKⅡ/ERK/CREB 信號通路，而該信號通路激活具有促進突觸的形成，增強突觸可塑性、LTP 等效應。同時水迷宮實驗表明銀杏二萜內酯葡胺能改善AD 大鼠的學習記憶障礙。

PSD95 是突觸后聯合的主要構成組件，與學習記憶形成、神經信息傳遞和突觸可塑性等過程具有密切聯系，在老年人和阿爾茨海默病患者腦內表達減少［19］。本研究結果顯示，銀杏二萜內酯葡胺能上調AD 大鼠海馬組織PSD95蛋白表達。BDNF 在學習和記憶的形成中發揮重要的作用［20-21］，轉BDNF 基因小鼠的認知功能和突觸可塑性有明顯的提升，而敲除BDNF 基因小鼠則表現出空間學習記憶能力的下降［22-23］。BDNF 能和神經元表面TrkB 結合并激活TrkB 和ERK/CREB 信號通路，在海馬刺激突觸發生和強化突觸間聯系、增加樹突棘密度和體積大小、參與神經發生、促進突觸可塑性、LTP 和記憶的形成中起關鍵作用。BDNF在海馬中的表達和認知功能呈現正相關性，在部分AD 轉基因動物和老齡動物的海馬中表達降低，且TrkB 的活性受到抑制［24］。本研究結果與上述研究結果一致，AD 大鼠海馬組織BDNF 蛋白表達降低，TrkB 信號通路受到抑制（即TrkB 磷酸化水平降低）； 而銀杏二萜內酯葡胺則能升高BDNF 蛋白表達并激活TrkB 通路。

綜上所述，銀杏二萜內酯葡胺可改善AD 大鼠的學習記憶功能，其機制可能與增加突觸相關蛋白NR2B 磷酸化水平和PSD95、BDNF 表達，并激活下游CaMK Ⅱ/ERK/CREB 和TrkB 信號通路相關。