銀藍調脂膠囊對ZDF 大鼠（fa/fa） 高脂血癥合并糖尿病的改善作用

甘海寧，鄭柳怡，黃雪君，彭 莎，黎樂怡，陳玉興*

［1.廣東省第二中醫院（廣東省中醫藥工程技術研究院），廣東 廣州 510095； 2.廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣東 廣州 510095； 3.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510275］

隨著我國人口老齡化與生活方式的變化，國內人群的血脂水平逐漸上升，血脂異常的患病率亦顯著增大。我國35 歲以上總人群血脂異常的患病率約為34.7%［1］，而血脂異常將導致心血管疾病事件（冠心病和中風） 的增加［2］。此外，糖尿病的流行亦帶來了嚴重的公共健康問題，2017年糖尿病占全球死因的10.7%，在中國就有超過84 萬患者死于糖尿病［3］。血脂、血糖的異常升高是糖脂代謝紊亂性疾病的主要特征。臨床觀察顯示，高血脂癥和糖尿病關系密切，高脂血癥合并有糖尿病的患者占高脂血癥總患者的21.20%［4］。因此，開發一種可有效地調節糖、脂代謝，并有可能降低糖脂代謝紊亂所引起的心腦血管疾病及并發癥的中藥制劑顯得尤為重要。

銀藍調脂膠囊由絞股藍、蜂膠、銀杏葉、化橘紅4 味中藥組成，為廣東省第二中醫院自主研發的中藥新制劑，具有益氣健脾、活血化瘀、祛痰利濕等功效，用于氣滯瘀血型高脂血癥的治療。前期實驗發現銀藍調脂膠囊具有較好的降脂作用［5］，在此基礎上，本實驗通過高脂飲食誘導ZDF 大鼠（fa/fa） 建立高脂血癥合并糖尿病模型，觀察銀藍調脂膠囊對該模型大鼠血脂、血糖、炎癥相關指標、肝臟脂質合成代謝關鍵酶乙酰輔酶A 羧化酶1 （ACC1）、脂肪酸合成酶（FAS） 及轉錄因子肝X 受體α （LXRα） 蛋白表達的影響，為探討銀藍調脂膠囊調脂、降糖的作用及機制提供重要的實驗依據。

1 材料

1.1 動物 24 只ZDF 模型大鼠（fa/fa），6 只ZDF 對照大鼠（fa/＋），雄性，SPF 級，體質量180 ～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK （京） 2016-0006。

1.2 藥物 銀藍調脂膠囊（批號J1911005） 由廣東省第二中醫院中藥制劑研究室提供。鹽酸二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，批號AAW6062，0.5 g/片）； 非諾貝特膠囊（美國雅培公司，批號27232，規格200 mg/粒）。

1.3 試劑 葡萄糖（GLU）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c） 檢測試劑盒 （批號20190831、20191018、20191018、20190714、20190714，南京建成生物工程研究所）； 大鼠腫瘤壞死因子-α （TNF-α）、白介素-6 （IL-6）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、脂聯素（ADPN）、瘦素（Leptin）、胰島素（INS） 酶聯免疫檢測試劑盒（批號569180611、385180619、603190419、118180619、396180619、358180619，天津安諾瑞康生物技術有限公司）； 乙酰輔酶A 羧化酶（ACC1）、脂肪酸合成酶（FAS）、轉錄因子肝X 受體α（LXRα）、β 肌動蛋白 （β-actin） 抗體 （貨號AF6421、BF0557、DF6864、AF7018，美國Affinity 公司）。

1.4 儀器 JJ500 型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；BSA2245 型電子天平［賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司］； 5450 型小型高速離心機 （德國Eppendorf 公司）；PowerPac 基礎電泳儀（美國Bio-Rad 公司）； 7020 型全自動生化分析儀（日本日立公司）； Varsoskan Flash 多功能酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）； TP1020 型全密封自動脫水機、RM2235 型輪式切片機、ST5020 型自動染色機（德國徠卡公司）； YD62 型石蠟包埋機、YD-6L 型智能冰凍包埋機（金華市益迪醫療設備有限公司）； DP2-BSW 型病理圖像采集系統（日本奧林巴斯公司）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥 ZDF 模型大鼠 （fa/fa） 飼喂Purina＃5008 誘導飼料（含粗蛋白23.5%、粗脂肪6.5%），ZDF 對照大鼠 （fa/＋） 飼喂正常大鼠維持飼料，每只50 g［6］。飼喂1 個月后，將ZDF 大鼠（fa/fa） 隨機分成模型組、非諾貝特＋二甲雙胍組（二甲雙胍0.180 g/kg＋非諾貝特0.018 g/kg） 和銀藍調脂膠囊高、低劑量組（5.148、2.574 g/kg），每組6 只； ZDF 大鼠（fa/＋） 作為正常組。各給藥組灌胃相應劑量藥物，正常組和模型組灌胃給予蒸餾水（10 mL/kg），每天1 次，連續12 周。其間除正常組外，其余各組持續飼喂誘導飼料。

2.2 血清糖脂代謝和炎癥相關指標檢測 末次給藥1 h后，各組大鼠禁食不禁水，麻醉后腹主動脈取血，全血3 000 r/min 離心10 min，收集血清，按相應試劑盒說明書檢測血清TC、TG、HDL-c、LDL-c、GLU、INS、HbA1c、ADP、TNF-α、Leptin 水平。

2.3 HE 染色觀察肝組織病理形態 大鼠處死后取肝臟，一部分于-80 ℃保存，用于蛋白免疫印跡實驗； 另一部分固定于多聚甲醛中，用于HE 染色。取固定于多聚甲醛的肝組織，行脫水、包埋、切片、脫蠟等操作后，常規HE染色，脫水后封片，于顯微鏡下觀察，并采用Image J 軟件定量分析脂滴空泡的相對面積比例。

2.4 蛋白免疫印跡法檢測肝組織ACC1、FAS、LXRα 蛋白表達 取大鼠肝組織約100 mg，加入1 mL RIPA 蛋白裂解液進行研磨，4 ℃放置10 min 后12 000 r/min 離心5 min，采用BCA 蛋白試劑盒測定上清液的蛋白濃度，加5×上樣緩沖液后進行蛋白變性。蛋白上樣后經電泳、轉膜、封閉，孵育一抗、二抗，添加ECL 化學發光液后于成像系統中顯影成像，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為內參計算ACC1、FAS、LXRα 蛋白相對表達量。

2.5 統計學分析 通過SPSS 20.0 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊時用SNK 法，方差不齊時用Dunnett’s T3法。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 銀藍調脂膠囊對ZDF 大鼠（fa/fa） 血脂水平的影響 如表1 所示，與正常組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-c 水平升高（P＜0.01），HDL-c 水平降低（P＜0.01）； 與模型組比較，非諾貝特＋二甲雙胍組和銀藍調脂膠囊各劑量組大鼠血清TC、TG、LDL-c 水平降低 （P＜0.05，P＜0.01），銀藍調脂膠囊高劑量組大鼠血清HDL-c水平升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清TC、TG、HDL-c、LDL-c 水平比較（mmol/L，±s，n＝6）

表1 各組大鼠血清TC、TG、HDL-c、LDL-c 水平比較（mmol/L，±s，n＝6）

注： 與正常組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別TCTGHDL-cLDL-c正常組4.078±0.3681.590±0.2301.588±0.1970.807±0.112模型組10.184±1.493**4.821±0.478**0.676±0.322**1.982±0.359**非諾貝特＋二甲雙胍組5.454±1.489＃＃2.911±0.385＃＃0.763±0.3930.984±0.103＃＃銀藍調脂膠囊高劑量組6.758±0.813＃＃3.483±0.707＃＃1.247±0.394＃1.132±0.146＃＃銀藍調脂膠囊低劑量組7.013±0.850＃＃3.862±0.461＃＃1.031±0.4091.314±0.088＃

3.2 銀藍調脂膠囊對ZDF 大鼠（fa/fa） 血清Leptin、ADPN水平的影響 如表2 所示，與正常組比較，模型組大鼠Leptin 水平升高（P＜0.01），ADPN 水平降低（P＜0.01）； 與模型組比較，非諾貝特＋二甲雙胍組和銀藍調脂膠囊各劑量組Leptin 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），ADPN 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 各組大鼠血清Leptin、ADPN 水平比較（±s，n＝6）

表2 各組大鼠血清Leptin、ADPN 水平比較（±s，n＝6）

注： 與正常組比較，** P ＜0.01； 與模型組比較，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別Leptin/（pg·mL-1）ADPN/（ng·mL-1）正常組298.633±81.56418.845±1.337模型組597.745±102.819**8.684±1.332**非諾貝特＋二甲雙胍組376.387±59.401＃＃15.031±1.675＃＃銀藍調脂膠囊高劑量組389.915±104.981＃＃12.738±3.099＃＃銀藍調脂膠囊低劑量組475.113±108.958＃11.297±2.471＃

3.3 銀藍調脂膠囊對ZDF 大鼠（fa/fa） 血糖的影響 如表3 所示，與正常組比較，模型組大鼠血清GLU、HbA1c水平升高（P＜0.01），INS 水平降低（P＜0.01）； 與模型組比較，非諾貝特＋二甲雙胍組和銀藍調脂膠囊各劑量組大鼠血清GLU、HbA1c 水平降低 （P＜0.01），INS 水平升高（P＜0.05）。

表3 各組大鼠血清GLU、GHB、INS 水平比較（±s，n＝6）

表3 各組大鼠血清GLU、GHB、INS 水平比較（±s，n＝6）

注： 與正常組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別GLU/（mmol·L-1）HbA1c/（mmol·L-1）INS/（pg·mL-1）正常組5.970±0.4721.854±0.925588.144±14.234模型組35.372±2.742**5.253±0.465**344.743±26.685**非諾貝特＋二甲雙胍組21.449±1.700＃＃2.561±0.395＃＃480.453±73.970＃銀藍調脂膠囊高劑量組22.545±2.259＃＃2.814±0.479＃＃437.778±41.780＃銀藍調脂膠囊低劑量組26.783±2.204＃＃3.147±0.316＃＃404.373±29.458＃

3.4 銀藍調脂膠囊對ZDF 大鼠（fa/fa） 血清TNF-α、IL-6水平的影響 如表4 所示，與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，非諾貝特＋二甲雙胍組、銀藍調脂膠囊各劑量組大鼠血清TNFα、IL-6 水平降低（P＜0.01）。

表4 各組大鼠血清TNF-α、IL-6 水平比較（±s，n＝6）

表4 各組大鼠血清TNF-α、IL-6 水平比較（±s，n＝6）

注： 與正常組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別TNF-α/（pg·mL-1）IL-6/（ng·mL-1）正常組67.904±4.08311.369±1.491模型組115.539±4.993**24.303±3.808**非諾貝特＋二甲雙胍組83.328±12.444＃＃14.733±1.821＃＃銀藍調脂膠囊高劑量組80.952±8.489＃＃17.851±2.116＃＃銀藍調脂膠囊低劑量組93.667±10.709＃＃18.807±3.071＃＃

3.5 銀藍調脂膠囊對ZDF 大鼠（fa/fa） 肝組織病理形態的影響 如圖1 所示，正常組肝細胞肝小葉結構清晰，胞漿紅染均勻一致，肝竇清晰可見，肝索排列整齊； 模型組可見肝索排列紊亂，肝細胞腫脹、氣球樣變，見有大量大小不等的圓形脂滴空泡； 與模型組比較，銀藍調脂膠囊各劑量大鼠肝組織肝竇較為清晰且肝索的排列相對整齊，脂滴空泡的數量也明顯減少，非諾貝特＋二甲雙胍組大鼠肝組織脂滴空泡明顯減少、變小，肝細胞腫脹較輕，肝竇較清晰，肝索排列較整齊。如表5 所示，與正常組比較，模型組大鼠肝組織脂滴空泡面積比例升高（P＜0.01）； 與模型組比較，非諾貝特＋二甲雙胍組和銀藍調脂膠囊各劑量組大鼠肝組織脂滴空泡面積比例降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 各組大鼠肝組織HE 染色（×200）

表5 各組大鼠肝組織脂滴空泡面積比例比較（±s，n＝6）

表5 各組大鼠肝組織脂滴空泡面積比例比較（±s，n＝6）

注： 與正常組比較，** P ＜0.01； 與模型組比較，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別脂滴空泡面積比例/%正常組0.239±0.189模型組44.232±9.356**非諾貝特＋二甲雙胍組14.836±3.760＃＃銀藍調脂膠囊高劑量組16.686±2.895＃＃銀藍調脂膠囊低劑量組25.552±4.009＃

3.6 銀藍調脂膠囊對ZDF 大鼠 （fa/fa） 肝組織ACC1、FAS、LXRα 蛋白表達的影響 如圖2 所示，與正常組比較，模型組大鼠肝組織ACC1 蛋白表達有升高趨勢，LXRα蛋白表達有降低趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05），FAS 蛋白表達升高（P＜0.01）； 與模型組比較，非諾貝特＋二甲雙胍組和銀藍調脂膠囊高劑量組大鼠肝組織ACC1、FAS 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），LXRα 蛋白表達有升高趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05），銀藍調脂膠囊低劑量組大鼠肝組織FAS 蛋白表達降低（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠肝組織ACC1、FAS、LXRα 蛋白表達（±s，n＝3）

4 討論

高脂血癥和2 型糖尿病均是我國乃至全球范圍內的常見病、多發病，而且大多數糖尿病患者除了表現出血糖的異常升高之外，往往還伴隨有脂質代謝異常的癥狀［7］。臨床上對高脂血癥合并糖尿病的治療主要以降脂藥和降糖藥聯用為主，口服降脂藥主要有貝特類、他汀類、煙酸及其衍生物等； 口服降糖藥主要有雙胍類、DPP-4 抑制劑類、磺脲類、噻唑烷二酮類、α-葡萄糖苷酶抑制劑等［8］。多種藥物聯用雖然達到一定的降糖降脂效果，但也大大地增加了用藥風險。因此，開發同時具有降脂、降糖作用，且毒副作用相對更少、更小的中成藥，具有很高的研究與應用價值。

銀藍調脂膠囊由絞股藍、蜂膠、銀杏葉、化橘紅組成，具有益氣健脾、活血化瘀、祛痰利濕等功效，適用于氣虛痰瘀阻痹型高脂血癥的治療。ZDF 大鼠（fa/fa） 是來源于高血糖Zucker 肥胖大鼠的近親繁殖，由于瘦素受體基因突變，在高脂飼料誘導下，極易引起肥胖、糖尿病，并伴隨有胰島素抵抗及高脂血癥［9］，更適合模擬人類糖脂代謝異常。因此，本實驗選擇ZDF 大鼠（fa/fa） 研究銀藍調脂膠囊對糖脂代謝異常的作用及機制。本實驗結果顯示，銀藍調脂膠囊能降低ZDF 大鼠血清TG、TC、LDL-c、GLU、HbA1c 水平，升高HDL-C、胰島素水平，證明其有較好的調血脂、降血糖作用，與臨床效果基本相符。

Leptin 由脂肪組織分泌，其在血清中的水平與動物脂肪組織大小成正比，對脂肪分解與運用有著重要的作用［10］。ADPN 由脂肪細胞分泌，是一種胰島素增敏激素，具有促進骨骼肌細胞脂肪酸氧化和糖吸收的作用，被認為是維持機體脂質及血糖穩態的重要調節因子［11-12］。本實驗結果顯示，銀藍調脂膠囊能降低ZDF 大鼠血清Leptin 水平，升高ADPN 水平，有助于改善ZDF 大鼠糖脂代謝紊亂狀態，這可能是銀藍調脂膠囊調節糖脂代謝的作用機制之一。

糖脂代謝紊亂被認為是一種以慢性高血脂、高血糖和細胞因子水平升高為特征的代謝性炎性疾病，提示炎癥在其病因學中起著因果作用。有研究表明，高脂血癥、糖尿病與IL-6、Leptin、CRP 和TNF-α 水平的升高密切相關［13-14］。IL-6 可對B 淋巴細胞分化起促進作用，也可通過與其他細胞因子及效應分子產生細胞毒作用，導致胰島β細胞死亡； TNF-α 參與慢性炎癥和多種代謝紊亂，TNF-α的過度表達可造成胰島素抵抗［15］。本實驗表明，銀藍調脂膠囊可降低ZDF 大鼠血清IL-6、TNF-α 水平，提示銀藍調脂膠囊可能通過降低炎癥因子水平而起到改善胰島素抵抗作用，進而調節機體糖脂代謝。

ACC1 和FAS 均是脂肪酸合成的關鍵酶，而LXRα 是調節膽固醇穩態的固醇敏感轉錄因子，調控多個組織（如肝臟、小腸、外周血細胞、腦等） 中與脂質合成、運輸和排泄相關基因的表達［16］； LXRα 亦是膽固醇逆向轉運途徑的重要調節因子［17-18］，是決定全身膽固醇水平的重要因素。本實驗結果顯示，銀藍調脂膠囊有升高肝組織LXRα 蛋白表達的趨勢，可降低ACCI 及FAS 蛋白表達，提示銀藍調脂膠囊可通過抑制肝臟脂肪生成相關蛋白，從而減少肝臟中的脂質積累。

綜上所述，銀藍調脂膠囊具有一定的降血脂、降血糖作用，能有效改善糖脂代謝紊亂狀態，其作用機制可能與改善體內脂質代謝與炎癥反應，調控肝組織ACC1、FAS 蛋白表達進而減少肝臟脂質的堆積有關。