漢黃芩素通過調控JNK/AP-1 信號通路對缺血性腦卒中大鼠神經功能障礙、腦組織損傷的影響

葉 維，張 紅，王 莉，徐建奇

（長江航運總醫院康復醫學科，湖北 武漢 430010）

缺血性腦卒中（cerebral ischemic stroke，CIS）占所有腦卒中病例的80% ～85%，其會引發炎癥、氧化應激和細胞凋亡等，造成腦損傷［1］。目前僅存在2 種已獲批準的治療選擇，即組織纖溶酶原激活劑和血管內血栓切除術，但較窄的治療窗和額外損傷的高風險限制了其適用性［2］。因此，探究CIS后腦損傷的新治療措施具有重要意義。漢黃芩素是從黃芩根中分離出來的天然成分。已有研究報道，其可抑制永久性大腦中動脈閉塞模型大鼠的缺血性腦損傷［3-4］。但關于漢黃芩素減輕CIS 大鼠腦損傷的具體機制尚不完全清楚。c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK） /激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1） 可介導腦損傷的發生，抑制該信號通路可改善腦出血后的神經炎癥［5］。而漢黃芩素能否通過調控JNK/AP-1 通路影響CIS大鼠神經功能障礙及腦組織損傷尚不明確。因此，本研究主要探究漢黃芩素對CIS 大鼠神經功能障礙、腦組織損傷的影響，以及漢黃芩素的作用機制，旨在為CIS 的臨床治療提供理論依據。

1 材料

1.1 動物 120 只雄性SD 大鼠，體質量220 ～240 g，購自廣東南模生物科技有限公司［實驗動物生產許可證號SCXK （粵） 2022-0062］。本研究經醫院動物倫理委員會批準。

1.2 試劑 漢黃芩素 ［貨號 YLK-B0292D，20 mg，純度≥98%，優利科（上海） 生命科學有限公司］。丁苯酞（貨號CS-B4908，上海莼試生物技術有限公司）； JNK 激活劑Anisomycin （貨號T6758，南京賽泓瑞生物科技有限公司）； 大鼠丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 試劑盒 （貨號FKkl1921、YM-SZ1922，上海遠慕生物科技有限公司）； TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒 ［貨號KTA2010-1，亞科因（武漢） 生物技術有限公司］；JNK1、c-Jun、c-Fos、p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos、β-actin、辣根過氧化物酶（HRP） 標記的羊抗兔二抗 （ 貨號 ab110724、ab40766、ab208942、ab47337、ab32137、ab278642、ab6276、ab6721，英國Abcam 公司）。

2 方法

2.1 模型構建 大鼠腹腔注射4%戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定于手術臺上，在頸正中部作一切口，分離頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，結扎頸總動脈、頸外動脈近心端，在頸總動脈近心端剪一小口，遠心端掛線，然后緩慢向頸內動脈插入線栓直至有阻力不能插入為止，回抽少許線栓，結扎頸內動脈，縫合傷口。術后神經功能評分高于1 分且低于4 分則為造模成功［6］。

2.2 分組及給藥 按照隨機數字表法將大鼠分為對照組、模型組、漢黃芩素低劑量組、漢黃芩素高劑量組、丁苯酞組、漢黃芩素高劑量＋JNK 激活劑（Anisomycin） 組，每組20 只。對照組大鼠僅切開皮膚、分離血管，不進行拴線處理； 其余各組大鼠均按“2.1” 項下方法構建模型。建模成功后，漢黃芩素低劑量組、漢黃芩素高劑量組［7］、丁苯酞組［8］大鼠分別灌胃 0.07 mg/kg 漢黃芩素、0.14 mg/kg漢黃芩素、20 mg/kg 丁苯酞，并腹腔注射等體積生理鹽水； 漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組［9］大鼠灌胃0.14 mg/kg 漢黃芩素，并腹腔注射5 mg/kg Anisomycin，每天1 次，持續14 d。

2.3 標本收集 造模結束后及末次給藥12 h 后，所有大鼠均進行神經功能評分。評分后取大鼠腦組織，其中5 個用于腦梗死體積測定，5 個用于腦組織含水量測定，5 個固定于4%多聚甲醛中用于HE染色、TUNEL 染色，5 個保存在液氮中用于Western blot 實驗和SOD 活性、MDA 水平檢測。

2.4 Zea-Longa 法評價神經功能 根據Zea-Longa評分系統［10］對每組20 只大鼠進行神經功能評分，其中0 分為無神經功能障礙癥狀，1 分為無法伸展對側前爪，2 分為行走時轉向偏癱側，3 分為傾倒到偏癱一側，4 分為不能自發行走、無意識。

2.5 TTC 染色測定腦梗死體積 取各組大鼠腦組織，PBS 洗滌后切成2 mm 切片，于1% TTC 溶液中37 ℃染色30 min，然后在10%甲醛中固定24 h，拍照并測定腦梗死體積，未染色區域被定義為梗死區域。腦梗死體積百分比＝ （梗死體積/大腦總體積） ×100%。

2.6 腦組織含水量測定 稱量大鼠腦組織總濕重，記為W1，置于65 ℃烘箱中烘干24 h，稱量其干重，記為W2。腦組織含水量＝ ［（W1-W2）/W1］ ×100%。

2.7 HE 染色觀察腦組織海馬CA1 區神經細胞病理變化 將大鼠海馬CA1 區腦組織于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，清水洗滌4 h，分級乙醇脫水，按照標準組織學程序包埋在石蠟中，切片4 μm，進行HE 染色，在光學顯微鏡下拍攝海馬CA1 區腦組織病理變化。

2.8 腦組織SOD 活性、MDA 水平檢測 按照試劑盒說明書檢測大鼠腦組織SOD 活性、MDA水平。

2.9 TUNEL 染色檢測大鼠腦組織神經細胞凋亡 取大鼠腦組織石蠟切片，嚴格按照TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行染色，熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況，Image Pro Plus 6.0 軟件分析細胞凋亡率。

2.10 Western blot 法檢測腦組織JNK/AP-1 信號通路相關蛋白表達 大鼠腦組織采用RIPA 裂解緩沖液裂解并提取總蛋白，蛋白定量后進行電泳、轉膜、封閉，加p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos、JNK1、c-Jun、c-Fos、β-actin 一抗4 ℃孵育過夜，然后與HRP 偶聯的二抗孵育2 h，ECL 法發光、顯影，Image J 軟件測量蛋白條帶灰度值。

2.11 統計學分析 通過SPSS 16.0 軟件進行處理，數據以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 漢黃芩素對大鼠神經功能評分的影響 與對照組比較，模型組大鼠神經功能評分升高 （P＜0.05）； 與模型組比較，漢黃芩素各劑量組和丁苯酞組大鼠神經功能評分降低（P＜0.05）； 與漢黃芩素高劑量組比較，漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組大鼠神經功能評分升高（P＜0.05），見表1。

表1 漢黃芩素對大鼠神經功能評分的影響（±s，n＝20）Tab.1 Effect of wogonin on neurological function score in rats （±s，n＝20）

表1 漢黃芩素對大鼠神經功能評分的影響（±s，n＝20）Tab.1 Effect of wogonin on neurological function score in rats （±s，n＝20）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與漢黃芩素高劑量組比較，△P＜0.05。

組別神經功能評分/分對照組0.00±0.00模型組2.78±0.21*漢黃芩素低劑量組2.15±0.14＃漢黃芩素高劑量組1.37±0.12＃丁苯酞組1.34±0.13＃漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組2.23±0.11△

3.2 漢黃芩素對大鼠腦梗死體積百分比的影響 模型組大鼠腦梗死體積百分比高于對照組（P＜0.05）； 與模型組比較，漢黃芩素各劑量組和丁苯酞組大鼠腦梗死體積百分比降低（P＜0.05）； 與漢黃芩素高劑量組比較，漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組大鼠腦梗死體積百分比升高 （P＜0.05），見圖1、表2。

圖1 各組大鼠腦組織TTC 染色Fig.1 TTC staining of rat brain tissue in each group

表2 漢黃芩素對大鼠腦梗死體積百分比的影響（±s，n＝5）Tab.2 Effect of wogonin on the percentage of cerebral infarction volume in rats （±s，n＝5）

表2 漢黃芩素對大鼠腦梗死體積百分比的影響（±s，n＝5）Tab.2 Effect of wogonin on the percentage of cerebral infarction volume in rats （±s，n＝5）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與漢黃芩素高劑量組比較，△P＜0.05。

組別腦梗死體積百分比/%對照組0.00±0.00模型組36.21±3.23*漢黃芩素低劑量組28.13±2.25＃漢黃芩素高劑量組15.62±1.34＃丁苯酞組14.98±1.20＃漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組26.65±2.21△

3.3 漢黃芩素對大鼠腦組織含水量的影響 與對照組比較，模型組大鼠腦組織含水量升高 （P＜0.05）； 與模型組比較，漢黃芩素各劑量組、丁苯酞組大鼠腦組織含水量降低（P＜0.05）； 與漢黃芩素高劑量組比較，漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組大鼠腦組織含水量升高（P＜0.05），見表3。

表3 漢黃芩素對大鼠腦組織含水量的影響（±s，n＝5）Tab.3 Effect of wogonin on water content in brain tissue of rats （±s，n＝5）

表3 漢黃芩素對大鼠腦組織含水量的影響（±s，n＝5）Tab.3 Effect of wogonin on water content in brain tissue of rats （±s，n＝5）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與漢黃芩素高劑量組比較，△P＜0.05。

組別腦組織含水量/%對照組75.53±4.17模型組95.23±4.11*漢黃芩素低劑量組88.48±4.32＃漢黃芩素高劑量組79.18±4.26＃丁苯酞組79.76±4.22＃漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組87.28±5.88△

3.4 漢黃芩素對大鼠腦組織海馬CA1 區神經細胞病理變化的影響 對照組大鼠腦組織海馬CA1 區神經細胞排列致密均勻，結構形態正常，細胞輪廓清晰，形態完整正常，核仁清晰可見； 模型組大鼠神經細胞核萎縮，部分細胞呈點狀壞死，神經細胞紊亂； 與模型組比較，漢黃芩素各劑量組、丁苯酞組大鼠腦組織海馬CA1 區神經細胞病理損傷減輕；與漢黃芩素高劑量組比較，漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組大鼠腦組織海馬CA1 區神經細胞病理損傷嚴重，見圖2。

圖2 各組大鼠腦組織海馬CA1 區HE 染色（×200）Fig.2 HE staining of rat hippocampal CA1 area in each group （×200）

3.5 漢黃芩素對大鼠腦組織SOD 活性和MDA 水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠腦組織SOD 活性降低（P＜0.05），MDA 水平升高（P＜0.05）； 與模型組比較，漢黃芩素各劑量組、丁苯酞組大鼠腦組織SOD 活性升高（P＜0.05），MDA水平降低（P＜0.05）； 與漢黃芩素高劑量組比較，漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組大鼠腦組織SOD 活性降低（P＜0.05），MDA 水平升高（P＜0.05），見表4。

表4 漢黃芩素對大鼠腦組織SOD 活性、MDA 水平的影響（±s，n＝5）Tab.4 Effects of wogonin on SOD activity and MDA level in brain tissue of rats （±s，n＝5）

表4 漢黃芩素對大鼠腦組織SOD 活性、MDA 水平的影響（±s，n＝5）Tab.4 Effects of wogonin on SOD activity and MDA level in brain tissue of rats （±s，n＝5）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與漢黃芩素高劑量組比較，△P＜0.05。

組別SOD/（U·mg-1） MDA/（nmol·mg-1）對照組67.74±4.052.31±0.22模型組25.58±1.12*8.86±0.42*漢黃芩素低劑量組36.12±2.03＃7.13±0.37＃漢黃芩素高劑量組59.52±2.78＃3.57±0.28＃丁苯酞組59.58±2.84＃3.59±0.25＃漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組 42.34±3.15△5.83±0.27△

3.6 漢黃芩素對大鼠神經細胞凋亡的影響 模型組大鼠神經細胞凋亡率高于對照組（P＜0.05）； 與模型組比較，漢黃芩素各劑量組、丁苯酞組大鼠腦組織神經細胞凋亡率降低（P＜0.05）； 與漢黃芩素高劑量組比較，漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組大鼠腦組織神經細胞凋亡率升高（P＜0.05），見圖3、表5。

圖3 各組大鼠腦組織神經細胞TUNEL 染色（×200）Fig.3 TUNEL staining of nerve cells in rat brain tissue of each group （×200）

表5 漢黃芩素對大鼠腦組織神經細胞凋亡的影響（±s，n＝5）Tab.5 Effect of wogonin on neuronal apoptosis in brain tissue of rats （±s，n＝5）

表5 漢黃芩素對大鼠腦組織神經細胞凋亡的影響（±s，n＝5）Tab.5 Effect of wogonin on neuronal apoptosis in brain tissue of rats （±s，n＝5）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與漢黃芩素高劑量組比較，△P＜0.05。

組別細胞凋亡率/%對照組4.17±0.31模型組39.87±3.06*漢黃芩素低劑量組26.87±2.12＃漢黃芩素高劑量組11.34±1.24＃丁苯酞組11.22±1.08＃漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組28.84±2.31△

3.7 漢黃芩素對大鼠腦組織p-JNK1、p-c-Jun、pc-Fos 蛋白表達的影響 模型組大鼠腦組織p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos 蛋白表達高于對照組（P＜0.05）； 與模型組比較，漢黃芩素各劑量組、丁苯酞組大鼠腦組織p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos 蛋白表達降低（P＜0.05）； 與漢黃芩素高劑量組比較，漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組大鼠腦組織p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos 蛋白表達升高（P＜0.05），見圖4、表6。

圖4 各組大鼠腦組織p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos 蛋白條帶Fig.4 Protein bands of p-JNK1，p-c-Jun and p-c-Fos in rat brain tissue of each group

表6 漢黃芩素對大鼠腦組織p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos 蛋白表達的影響（±s，n＝5）Tab.6 Effects of wogonin on the protein expressions of p-JNK1，p-c-Jun and p-c-Fos in brain tissue of rats （±s，n＝5）

表6 漢黃芩素對大鼠腦組織p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos 蛋白表達的影響（±s，n＝5）Tab.6 Effects of wogonin on the protein expressions of p-JNK1，p-c-Jun and p-c-Fos in brain tissue of rats （±s，n＝5）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與漢黃芩素高劑量組比較，△P＜0.05。

組別p-JNK1/JNK1p-c-Jun/c-Junp-c-Fos/c-Fos對照組0.28±0.020.21±0.020.15±0.01模型組0.94±0.05*0.95±0.04*0.89±0.10*漢黃芩素低劑量組0.70±0.07＃0.71±0.06＃0.70±0.06＃漢黃芩素高劑量組0.39±0.03＃0.34±0.03＃0.31±0.03＃丁苯酞組0.38±0.03＃0.32±0.03＃0.30±0.02＃漢黃芩素高劑量＋Anisomycin 組0.74±0.06△0.71±0.06△0.67±0.06△

4 討論

CIS 被認為是世界上發病率、死亡率和致殘率都很高的主要致命疾病之一［11］。腦卒中是全球人類死亡的主要原因，預計到2030 年將增加24.9%［12］。但目前關于CIS 的治療策略較少，因此，開發新的藥物來治療CIS 引起的腦損傷具有重要意義。改良的線栓法是常用于構建CIS 模型的方法，本研究利用此方法構建CIS 大鼠模型，結果顯示，與對照組比較，模型組神經功能評分、腦梗死體積百分比、腦組織含水量、氧化應激水平、神經細胞凋亡率升高，海馬CA1 區神經細胞病理損傷嚴重，表明CIS 模型大鼠存在神經功能障礙及腦組織損傷。

漢黃芩素是黃芩的主要化學成分，是含有苯并吡喃酮的黃酮衍生物，具有抗氧化、抗炎、保護神經等作用［13］。據報道，漢黃芩素可減輕麻醉大鼠創傷性腦損傷的有害影響［14］； 也可通過減少細胞凋亡對創傷性腦損傷發揮保護作用［15］。而關于漢黃芩素對CIS 大鼠神經功能障礙及腦組織損傷的影響鮮有報道。本研究顯示，漢黃芩素可降低CIS 大鼠神經功能評分、腦梗死體積百分比、腦組織含水量、氧化應激水平、神經細胞凋亡率，可使海馬CA1 區神經細胞病理損傷減輕，且漢黃芩素高劑量組與丁苯酞組效果相近，表明漢黃芩素可改善CIS 大鼠神經功能障礙及腦組織損傷。

JNK 和c-Jun 磷酸化是關鍵的細胞凋亡驅動因素，一旦被激活，他們就可以與c-Fos 和c-Jun 家族的成員共同形成AP-1 來調控細胞凋亡［16-17］。相關研究顯示，抑制JNK/AP-1 通路可減少新生兒缺氧缺血性腦損傷后的神經元凋亡并改善運動行為［18］； 還可降低缺血再灌注后神經細胞凋亡數，進而保護脊髓組織［19］。本研究顯示，與對照組比較，模型組大鼠腦組織p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos蛋白表達升高； 與模型組比較，漢黃芩素各劑量組和丁苯酞組大鼠腦組織p-JNK1、p-c-Jun、p-c-Fos蛋白表達降低，推測漢黃芩素可能通過抑制JNK/AP-1 通路改善CIS 大鼠神經功能障礙及腦組織損傷。為了驗證該猜想，本研究在高劑量漢黃芩素處理的基礎上加以JNK 激活劑Anisomycin 干預CIS大鼠，結果顯示Anisomycin 減弱了高劑量漢黃芩素對CIS 大鼠神經功能障礙及腦組織損傷的改善作用，證實了漢黃芩素可能通過抑制JNK/AP-1 通路改善CIS 大鼠神經功能障礙，減輕腦組織損傷的作用。

綜上所述，漢黃芩素可能通過抑制JNK/AP-1通路改善CIS 大鼠神經功能障礙及腦組織損傷。然而，漢黃芩素對CIS 大鼠神經功能障礙及腦組織損傷的改善作用可能還涉及其它通路，但本研究還未闡明，這將是本課題組后續研究的重點。