碳青霉烯類(lèi)耐藥革蘭陰性桿菌耐藥基因的研究進(jìn)展*

張曉靜,孟祥璐 綜述,李 靜 審校

1.菏澤醫(yī)學(xué)專(zhuān)科學(xué)校藥學(xué)與檢驗(yàn)系,山東菏澤 274000;2.青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系,山東青島 266021;3.山東省鄆城縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,山東菏澤 274700;4.青島大學(xué)附屬醫(yī)院嶗山院區(qū)檢驗(yàn)科,山東青島 266035

抗菌藥物的長(zhǎng)期不規(guī)范使用或?yàn)E用是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增加的重要因素之一。目前國(guó)內(nèi)大多數(shù)醫(yī)院根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)下發(fā)的文件,主要監(jiān)測(cè)的多重耐藥菌包括碳青霉烯類(lèi)耐藥的腸桿菌(CRE)、碳青霉烯類(lèi)耐藥的銅綠假單胞菌(CRPA)、碳青霉烯類(lèi)耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌(CRAB)、耐萬(wàn)古霉素腸球菌(VRE)及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)。2017年,世界衛(wèi)生組織公布的急需研發(fā)新型藥物的重點(diǎn)病原體名單中,CRE、CRPA與CRAB被列為優(yōu)先Ⅰ級(jí)(危急)[1]。

在臨床分離的致病菌中,革蘭陰性桿菌(GNB)的分離率較高,GNB可導(dǎo)致呼吸道、泌尿道等感染及敗血癥的發(fā)生,使患者的痛苦增加并且延長(zhǎng)住院時(shí)間[2]。在治療嚴(yán)重感染性疾病的藥物中,碳青霉烯類(lèi)藥物是目前臨床上已經(jīng)被廣泛使用的抗菌藥物,主要用于GNB感染的治療,該類(lèi)藥物還能對(duì)革蘭陽(yáng)性球菌起到良好的抗菌作用,同時(shí)對(duì)厭氧菌也有很好的療效。但是,隨著該類(lèi)藥物的使用越來(lái)越多,碳青霉烯類(lèi)耐藥的革蘭陰性桿菌(CRO)不斷增加,為臨床抗感染藥物的選擇造成困難,CRO感染已經(jīng)成為全球化的公共衛(wèi)生問(wèn)題。CRO定義為對(duì)亞胺培南(IPM)、美羅培南(MEM)和厄他培南中任意一種藥物耐藥的GNB。CRO感染的臨床治療具有挑戰(zhàn)性,目前臨床上僅有頭孢他啶-阿維巴坦等少數(shù)幾種新型藥物有效,并且此類(lèi)藥物針對(duì)性強(qiáng),對(duì)于產(chǎn)金屬酶的菌株抗菌活性差,因此很有必要檢測(cè)細(xì)菌是否產(chǎn)碳青霉烯酶及產(chǎn)哪種類(lèi)型的碳青霉烯酶。這就要求臨床根據(jù)體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果、產(chǎn)酶的類(lèi)型及患者感染的嚴(yán)重程度,采用個(gè)體化治療方案來(lái)治療CRO的感染。

1 CRO的種類(lèi)

1.1CRE 腸桿菌是最常見(jiàn)的引起感染性疾病的GNB,約占GNB感染的80%。資料顯示2014-2020年,全國(guó)GNB致病菌分離率居前3位的是大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌(KPN)、銅綠假單胞菌(PA)[3]。碳青霉烯類(lèi)藥物是目前臨床上已經(jīng)被廣泛使用的抗菌藥物,隨著這類(lèi)藥物的使用頻率增加,對(duì)其耐藥的腸桿菌也不斷增加,CRE在臨床醫(yī)療機(jī)構(gòu)快速播散。頭孢他啶-阿維巴坦被認(rèn)為是治療CRE的首選藥物,與其他抗菌藥物(包括多黏菌素)相比,頭孢他啶-阿維巴坦可提高臨床治愈率[4]。我國(guó)CRE以KPN為主,此菌具有強(qiáng)大的將獲得的耐藥基因進(jìn)行傳播的能力。目前,隨著醫(yī)院使用抗菌藥物越來(lái)越規(guī)范,2019年和2020年,KPN對(duì)MEM和IPM的耐藥率有所降低,但是檢出的KPN菌株數(shù)仍然比較多[5]。鄒鳳梅等[6]報(bào)道顯示,51株CRE臨床分離菌株中20株為KPN。CRE的主要耐藥機(jī)制是產(chǎn)碳青霉烯酶,不同國(guó)家臨床分離菌株產(chǎn)碳青霉烯酶的種類(lèi)有所差異,這種差異取決于不同菌株攜帶的耐藥基因不同[7]。在希臘醫(yī)院進(jìn)行的一項(xiàng)多中心全國(guó)監(jiān)測(cè)中,臨床分離的CRE菌株攜帶的blaKPC基因占首位,blaNDM基因占第2位[8];在阿拉伯半島,blaNDM-1是最常見(jiàn)的耐藥基因(46.5%);在阿拉伯聯(lián)合酋長(zhǎng)國(guó)并未檢測(cè)到表達(dá)blaKPC基因的分離株;在歐洲,38%的CRE可檢測(cè)到blaOXA-48基因,僅次于攜帶blaKPC基因的腸桿菌科細(xì)菌(42%),但高于攜帶blaNDM基因的腸桿菌(12%);我國(guó)西南地區(qū)臨床分離的CRE菌株以攜帶blaIMP-9基因和blaVIM-2基因?yàn)橹?而我國(guó)大部分地區(qū)CRE菌株主要攜帶blaKPC和blaNDM基因[10]。臨床分離菌株攜帶的耐藥基因在不同種類(lèi)細(xì)菌之間不同,其中KPN主要攜帶blaKPC-2基因,陰溝腸桿菌主要攜帶blaNDM-1基因亞型,大腸埃希菌主要攜帶blaNDM-5基因亞型。從CRE分離出的耐藥基因在成人與兒童患者中也存在差異:從成人分離出的CRE中以blaKPC-2型耐藥基因?yàn)橹?而兒童主要以blaNDM型耐藥基因?yàn)橹鳌Ｓ袌?bào)道稱(chēng),blaOXA-232基因在兒童患者的KPN中檢測(cè)出,并且blaOXA-232基因可能會(huì)成為繼blaKPC-2和blaNDM基因之后我國(guó)“第三種流行”的碳青霉烯酶基因[11]。HAN等[12]對(duì)CRE菌株進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型(MLST)發(fā)現(xiàn),ST11型在我國(guó)最常見(jiàn),主要分布在我國(guó)北部、南部、東部、中部、東北部和西南部,其次是ST17型,主要分布在西北部地區(qū)。

1.2CRPA PA是臨床常見(jiàn)的機(jī)會(huì)性感染病原菌之一,是一種對(duì)生存環(huán)境要求不高的專(zhuān)性需氧菌。在機(jī)體免疫功能低下時(shí),PA極易發(fā)生嚴(yán)重的皮膚、泌尿系統(tǒng)等感染,還可進(jìn)入血液中導(dǎo)致菌血癥乃至敗血癥。臨床標(biāo)本中分離的PA分為黏液型和非黏液型,雖然藥敏結(jié)果顯示黏液型對(duì)抗菌藥物相對(duì)敏感,但在臨床治療過(guò)程中并不能達(dá)到理想的效果,主要由于黏液型PA可以在菌體外形成生物膜而阻止抗菌藥物進(jìn)入菌體,生物膜的形成可使黏液型PA在抗菌藥物環(huán)境下生存,導(dǎo)致臨床治療的失敗。自20世紀(jì)80年代,碳青霉烯類(lèi)藥物被推薦作為該病原體引起的感染治療后,就出現(xiàn)了CRPA及更為嚴(yán)重的多藥耐藥性(MDR)、廣泛耐藥性(XDR)甚至全耐藥(PDR),同時(shí)由于PA對(duì)于多種抗菌藥物存在固有耐藥現(xiàn)象,因此該菌的治療難度比其他GNB更大,使CRPA成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題[13]。近幾年,隨著臨床抗菌藥物使用的規(guī)范化,我國(guó)對(duì)MEM及IPM耐藥的PA檢出率有所下降[5],但CRPA的耐藥機(jī)制比其他大部分GNB更為復(fù)雜,大致上包括產(chǎn)碳青霉烯酶和非產(chǎn)酶兩種,在非產(chǎn)酶因素中,外排泵過(guò)表達(dá)是CRPA產(chǎn)生的主要原因,而外膜蛋白Opr-D2缺失可導(dǎo)致PA對(duì)MEM的敏感性降低。產(chǎn)酶機(jī)制中金屬β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生是導(dǎo)致CRPA耐藥的主要因素,目前已發(fā)現(xiàn)的主要有IMP、KHM、DIM、VIM、SPM、GIM、SIM、AIM和NDM 9種,我國(guó)主要以IMP和VIM碳青霉烯酶為主。自2006年在廣州分離的7株CRPA菌株中發(fā)現(xiàn)blaIMP-9基因后,攜帶blaIMP-9和blaVIM-2基因的菌株已成為我國(guó)CRPA的常見(jiàn)亞型。檢測(cè)出絲氨酸碳青霉烯酶或OXA型絲氨酸碳青霉烯酶的CRPA也被報(bào)道:楊春等[14]在濟(jì)南某兒童醫(yī)院檢測(cè)出1株CRPA攜帶blaOXA-10型耐藥基因。

1.3CRAB 鮑曼不動(dòng)桿菌(AB)是一種非發(fā)酵的GNB,是造成醫(yī)院感染的重要病原菌。此菌易在醫(yī)院用水、醫(yī)療物品等醫(yī)院環(huán)境中及患者皮膚表面廣泛存在并長(zhǎng)期存活。有報(bào)道顯示,AB的感染主要以呼吸系統(tǒng)為主,一般造成醫(yī)院獲得性肺炎,尤其是長(zhǎng)期住院、有基礎(chǔ)疾病、接受侵入性醫(yī)療操作、使用廣譜抗菌藥物的重癥監(jiān)護(hù)室內(nèi)的老年患者,極易引起嚴(yán)重的感染[15]。我國(guó)AB臨床分離率較高,2020年和2021年在非發(fā)酵的GNB中均位于第2位,分別為33.3%和31.9%[5]。近年來(lái)隨著碳青霉烯類(lèi)藥物被用作治療AB感染,CRAB的分離率逐年增高,并且CRAB也會(huì)產(chǎn)生對(duì)其他種類(lèi)抗菌藥物耐藥的情況,這就給抗AB感染的治療帶來(lái)了巨大困難。AB耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣,與CRE和CRPA相似,其最常見(jiàn)的耐藥機(jī)制是產(chǎn)生水解碳青霉烯類(lèi)藥物的酶,這種酶是由細(xì)菌自身產(chǎn)生,可降解進(jìn)入患者體內(nèi)的抗菌藥物,導(dǎo)致抗菌藥物不能與形成細(xì)胞壁的物質(zhì)——青霉素結(jié)合蛋白有效結(jié)合,從而使菌株對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥。其中最常見(jiàn)的是OXA型絲氨酸碳青霉烯酶,國(guó)內(nèi)80%的CRAB分離菌株均可產(chǎn)生OXA-23型酶,該酶是蘇格蘭人在AB中發(fā)現(xiàn)的第1種碳青霉烯酶[16]。隨后又在菌株中分離出OXA-24、OXA-25、OXA-51等OXA型酶,其中與菌株耐藥沒(méi)有關(guān)系的是OXA-51,OXA-51型酶的檢出只是用于證實(shí)菌株的存在[17]。同時(shí),AB中還檢測(cè)出了IMP、SIM、VIM類(lèi)等金屬β-內(nèi)酰胺酶,產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的CRAB在我國(guó)各地區(qū)的檢出率存在差異。除此之外,RND外排泵激活與菌株耐藥性有很大的關(guān)系。外排泵在賦予菌株耐藥表型的同時(shí),也使菌株獲得了其他類(lèi)型的耐藥機(jī)制。AdeABC系統(tǒng)、AdeIJK系統(tǒng)、AdeFGH系統(tǒng)是其主要類(lèi)型,其中AdeABC系統(tǒng)是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的RND外排泵,一旦菌株環(huán)境改變或者發(fā)生基因突變,其中任何一個(gè)外排泵過(guò)度表達(dá)都會(huì)使菌株對(duì)藥物的敏感性降低。同時(shí),與CRAB有關(guān)的使細(xì)菌通透性改變的主要是外膜孔蛋白CarO的表達(dá)[15]。AB還會(huì)通過(guò)多種機(jī)制使β-內(nèi)酰胺類(lèi)的抗菌藥物與青霉素結(jié)合蛋白的結(jié)合力降低,導(dǎo)致菌株的耐藥現(xiàn)象出現(xiàn)。

2 碳青霉烯酶的分類(lèi)

CRO的耐藥機(jī)制呈現(xiàn)復(fù)雜性和多樣性,主要有以下幾種:產(chǎn)碳青霉烯酶,水解碳青霉烯類(lèi)藥物;主動(dòng)外排功能亢進(jìn),使菌株主動(dòng)將抗菌藥物排出體外;外膜孔徑蛋白減少或丟失后導(dǎo)致孔徑蛋白通透性降低,從而使抗菌藥物不能進(jìn)入菌體內(nèi);藥物作用靶位青霉素結(jié)合蛋白的改變,使藥物不能抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成,從而不能發(fā)揮抑菌或殺菌作用;生物膜形成后,能夠阻止藥物進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi),使藥物不能達(dá)到有效的抗菌濃度等。其中,最重要的耐藥機(jī)制是產(chǎn)碳青霉烯酶。

2.1絲氨酸碳青霉烯酶 該酶是全球腸桿菌目細(xì)菌特別是KPN主要產(chǎn)生的耐藥性酶類(lèi)[11],產(chǎn)生該類(lèi)酶的菌株對(duì)乙二胺四乙酸(EDTA)不敏感,對(duì)大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物耐藥,目前處于臨床研究階段的美羅培南-韋博巴坦和亞胺培南-瑞來(lái)巴坦對(duì)產(chǎn)KPC型絲氨酸碳青霉烯酶菌株具有高度抗菌活性[18]。blaKPC是CRO產(chǎn)生的最常見(jiàn)的耐藥基因,主要有blaKPC-2、blaKPC-3、blaKPC-15等多種亞型,我國(guó)CRE分離株以攜帶blaKPC-2亞型最常見(jiàn),blaKPC-2可通過(guò)質(zhì)粒在不同菌種之間傳播,多數(shù)情況下這些質(zhì)粒還攜帶多種其他耐藥基因,導(dǎo)致菌株能水解多種抗菌藥物,對(duì)多種藥物表現(xiàn)出耐藥性。近兩年來(lái)產(chǎn)KPC型絲氨酸碳青霉烯酶在治療過(guò)程中快速突變而導(dǎo)致臨床抗感染治療失敗是當(dāng)前全球需重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題[7]。也有PA中檢出blaKPC-2亞型的報(bào)道,除此之外,SHV、GES、TEM等絲氨酸碳青霉烯酶也可以在PA中檢出,其中VEB是PA中最常見(jiàn)的A類(lèi)酶[19]。

2.2金屬β-內(nèi)酰胺酶 EDTA可抑制該類(lèi)酶的活性,產(chǎn)生該類(lèi)酶的菌株對(duì)碳青霉烯類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)、青霉素類(lèi)抗菌藥物均耐藥,但是對(duì)氨曲南敏感。目前處于臨床研究階段的美羅培南-韋博巴坦和亞胺培南-瑞來(lái)巴坦對(duì)產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶菌株無(wú)抗菌活性[18]。到目前為止,已發(fā)現(xiàn)的金屬β-內(nèi)酰胺酶有VIM、IMP、NDM、SPM等9種,我國(guó)臨床分離的CRE菌株主要產(chǎn)生的金屬β-內(nèi)酰胺酶為blaNDM和blaIMP基因型。我國(guó)臨床分離的CRPA菌株產(chǎn)生的金屬β-內(nèi)酰胺酶以blaIMP-9和blaVIM-2基因型為主。臨床菌株攜帶的金屬酶編碼基因有天然來(lái)源的,也有獲得性的。天然來(lái)源的金屬酶編碼基因在臨床使用碳青霉烯類(lèi)藥物之前就已經(jīng)產(chǎn)生,基因主要存在于細(xì)菌染色體上,只能垂直傳播并且傳播范圍相對(duì)較小;而獲得性的金屬酶編碼基因可以通過(guò)質(zhì)粒結(jié)合后傳遞或者移動(dòng)元件在不同菌種之間傳播,給監(jiān)控醫(yī)院感染帶來(lái)了很大困難。

2.3OXA型絲氨酸碳青霉烯酶 該酶的活性可以被一些含酶抑制劑的復(fù)合藥物滅活或抑制。產(chǎn)此酶的菌株活性能被頭孢他啶-阿維巴坦所抑制,但美羅培南-韋博巴坦和亞胺培南-瑞來(lái)巴坦對(duì)產(chǎn)此酶的菌株無(wú)抗菌活性。此酶只水解青霉素類(lèi)和碳青霉烯類(lèi)藥物,對(duì)超廣譜頭孢菌素類(lèi)藥物的水解能力較弱。blaOXA-23是不動(dòng)桿菌屬攜帶的主要耐藥基因,除此之外在不動(dòng)桿菌屬臨床分離菌株中還可檢測(cè)到blaOXA-40、blaOXA-58和blaOXA-143耐藥基因[20]。臨床常見(jiàn)的blaOXA-48耐藥基因的亞型為blaOXA-181和blaOXA-232,常見(jiàn)于腸桿菌科細(xì)菌[7]。

3 CRO的檢測(cè)方法

表型檢測(cè)和基因型檢測(cè)是常見(jiàn)的兩大類(lèi)檢測(cè)碳青霉烯酶的方法,其中基因型檢測(cè)主要包括酶免疫層析技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)等。但是在基層醫(yī)院,耐藥基因型的檢測(cè)由于需要專(zhuān)門(mén)的儀器設(shè)備,且價(jià)格昂貴,推廣和開(kāi)展難度較大。表型檢測(cè)雖然比較單一,不能全面檢測(cè)產(chǎn)生的碳青霉烯酶,但是具有操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn),已在各縣級(jí)醫(yī)院常規(guī)開(kāi)展。臨床常用的表型檢測(cè)主要有碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)、Carba NP試驗(yàn)等。

3.1碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn) 碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)根據(jù)絲氨酸碳青霉烯酶和金屬β-內(nèi)酰胺酶的特點(diǎn)而設(shè)計(jì),利用了3-氨基苯硼酸(APB)可以抑制A類(lèi)絲氨酸碳青霉烯酶的活性,而EDTA可以抑制金屬β-內(nèi)酰胺酶的活性的特點(diǎn)[21]。APB聯(lián)合EDTA既可以檢測(cè)單產(chǎn)A類(lèi)絲氨酸酶、單產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶,又可以檢測(cè)同時(shí)產(chǎn)生兩種不同類(lèi)型酶的腸桿菌目細(xì)菌。王璐等[22]對(duì)227株臨床分離菌株的研究表明,該方法對(duì)單產(chǎn)A類(lèi)絲氨酸酶或金屬β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)的靈敏度及單產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的特異度均為100.0%,與PCR相比,具有較高的檢測(cè)一致性。此方法操作簡(jiǎn)便,對(duì)技術(shù)要求不高。與改良的碳青霉烯滅活試驗(yàn)(mCIM)聯(lián)合EDTA改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)(eCIM)相比,此方法可以檢測(cè)同時(shí)產(chǎn)生兩類(lèi)酶的菌株,但不能檢測(cè)攜帶blaOXA-48耐藥基因的菌株,檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。

3.2Carba NP試驗(yàn) Carba NP試驗(yàn)是美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)在2015年提出的一種新的表型檢測(cè)試驗(yàn)。該試驗(yàn)的檢測(cè)原理主要依據(jù)細(xì)菌裂解液能體外水解碳青霉烯類(lèi)藥物IPM,以苯酚紅為指示劑,藥物水解后使溶液的pH值發(fā)生變化而發(fā)生指示劑顏色變化來(lái)判斷結(jié)果。Carba NP試驗(yàn)具有高靈敏度和特異度的優(yōu)點(diǎn),對(duì)產(chǎn)生KPC、VIM、NDM酶的腸桿菌目細(xì)菌具有高于90.0%的靈敏度和特異度,對(duì)含有碳青霉烯酶的假單胞菌屬具有100.0%的特異度和94.4%的靈敏度。但是如果菌株產(chǎn)生染色體介導(dǎo)blaOXA-48耐藥基因,Carba NP試驗(yàn)對(duì)blaOXA-48基因的靈敏度僅為6.0%。為提高該試驗(yàn)的靈敏度及檢測(cè)blaOXA-48耐藥基因的靈敏度,NORDMANN等[23]開(kāi)發(fā)了nitrospeedcarba NP試驗(yàn),該方法檢測(cè)OXA-48型碳青霉烯酶的靈敏度為100.0%,特異度為97.0%。并且有研究將氧化鋯珠添加到細(xì)菌懸液中促進(jìn)菌體裂解,同時(shí)增加細(xì)菌量獲得濃縮提取物,可將blaOXA-48基因檢測(cè)的靈敏度從56.0%提高至71.0%。Carba NP試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)為檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度和特異度高,適合基層實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。缺點(diǎn)為部分試劑需要自制并且保質(zhì)期短,目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了含亞胺培南的長(zhǎng)保質(zhì)期的試劑,彌補(bǔ)了這一不足。如果由其他機(jī)制導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性產(chǎn)生,該試驗(yàn)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陰性,且該方法對(duì)結(jié)果的顏色變化判斷存在一定的主觀性和實(shí)驗(yàn)室之間的技術(shù)差異。

3.3酶免疫層析技術(shù) 此技術(shù)是基于抗原抗體免疫反應(yīng),以培養(yǎng)后獲得的純細(xì)菌菌落為基礎(chǔ)的體外定性檢測(cè)的方法。這種方法能夠檢測(cè)KPC、NDM、VIM、IMP、OXA-48 5種碳青霉烯酶中的一種或者幾種,鑒定患者對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物是否產(chǎn)生耐藥性。此技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的最快速的技術(shù),具有操作簡(jiǎn)單、快速,不需要大型的設(shè)備,結(jié)果容易判讀的優(yōu)點(diǎn)。在臨床上檢測(cè)自危重癥患者標(biāo)本中分離出的CRE時(shí),可以采用此方法,以協(xié)助臨床快速制訂個(gè)體化治療方案[7]。但這種方法的缺點(diǎn)是價(jià)格貴,臨床還不能用于常規(guī)檢測(cè)。李靜等[24]采用膠體金免疫層析技術(shù)(將5種碳青霉烯酶的單克隆抗體與膠體金結(jié)合,再固定在醋酸纖維素薄膜上)對(duì)79株CRE菌株進(jìn)行產(chǎn)酶檢測(cè),并與PCR檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果發(fā)現(xiàn)膠體金免疫層析技術(shù)的靈敏度和特異度均為100.0%。GLUPCZYNSKI等[25]使用resistance-4 K-SeT方法分別對(duì)KPC、NDM、VIM、OXA-48型酶進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),resistance-4 K-SeT檢測(cè)OXA-48、KPC和NDM酶的靈敏度為100.0%,檢測(cè)VIM酶的靈敏度為97.4%,檢測(cè)所有碳青霉烯酶的特異度均為100.0%。

3.4PCR技術(shù) PCR技術(shù)是目前檢測(cè)碳青霉烯酶中應(yīng)用最多的一代測(cè)序手段。此技術(shù)不僅可以檢測(cè)菌株是否產(chǎn)碳青霉烯酶,而且可以檢測(cè)產(chǎn)酶的基因型。目前,已有多種碳青霉烯酶檢測(cè)的多重PCR技術(shù)。與單純PCR相比,多重PCR反應(yīng)的靈敏度更高。在用單純PCR檢測(cè)為陰性結(jié)果時(shí),所有基因都可能被懷疑的情況下,多重PCR篩查方案可作為一線(xiàn)篩查應(yīng)用,降低了多次PCR的成本。PCR技術(shù)由于擴(kuò)增和電泳耗時(shí),在臨床的應(yīng)用受到了一定的限制。為了使檢測(cè)更加方便快捷,臨床已普遍采用熒光定量PCR技術(shù),該技術(shù)不需要純的菌落,用臨床樣本就可以檢測(cè),檢測(cè)速度快,1 h就可以出結(jié)果,具有較高的靈敏度和特異度。但是熒光定量PCR技術(shù)主要對(duì)KPC、VIM、NDM、OXA-48和IMP酶進(jìn)行檢測(cè),并且價(jià)格相對(duì)較貴。

3.5二代測(cè)序技術(shù) 二代測(cè)序又稱(chēng)為高通量測(cè)序,此技術(shù)引入了可逆終止末端,實(shí)現(xiàn)邊合成邊測(cè)序,通過(guò)捕捉新添加的鏈末端熒光標(biāo)志確定DNA序列。二代測(cè)序除可檢測(cè)血液標(biāo)本外,還可檢測(cè)糞便、組織等各種標(biāo)本,可覆蓋多種病原體和耐藥基因,尤其是未知基因。二代測(cè)序技術(shù)在人類(lèi)醫(yī)學(xué)的主要應(yīng)用有全基因組測(cè)序[26],尋找大量的單核苷酸變異、插入缺失變異等;全外顯子組測(cè)序技術(shù)主要應(yīng)用于癌癥、遺傳性疾病等領(lǐng)域,尋找癌癥相關(guān)的突變;轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)用于分析轉(zhuǎn)錄信息,尋找個(gè)體間基因表達(dá)的差異和靶向區(qū)域測(cè)序等。二代測(cè)序技術(shù)具有通量高、讀長(zhǎng)短(不超過(guò)500 bp)的特點(diǎn),已在微生物耐藥機(jī)制、新病原體的發(fā)現(xiàn)等方面有所應(yīng)用,即將成為醫(yī)院疾病檢測(cè)的新工具。

4 小 結(jié)

綜上所述,在抗菌藥物選擇壓力下,在不同菌株中可檢測(cè)出碳青霉烯酶,并且能夠在菌種之間相互傳播,對(duì)醫(yī)院內(nèi)感染的監(jiān)測(cè)帶來(lái)極大困難。由于不同醫(yī)院所使用抗菌藥物的類(lèi)型有所差異,因此,研究簡(jiǎn)單快速、特異的適合各級(jí)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)CRO表型及基因型的方法對(duì)CRO的控制及治療起了關(guān)鍵作用。