VAMS與LC-MS/MS技術(shù)聯(lián)合及其臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展*

藍(lán)倩雯,潘永圣 綜述,尹利民△ 審校

1.昆明醫(yī)科大學(xué)研究生院,云南昆明 650500;2.云南省昆明市第一人民醫(yī)院檢驗科,云南昆明 650051

微量采樣技術(shù)是一種收集微量(<50 μL)體液用于分析的技術(shù),能促進(jìn)生物分析小型化和微量化,尤其對血液收集友好,主要技術(shù)包括干血斑(DBS)法、體積吸收微量采樣(VAMS)法、毛細(xì)管微量采樣(CMS)法和固相微萃取(SPME)法等,其中DBS法與VAMS法屬于干血法,患者可利用這兩種方法在家中收集血液樣本,待樣本干燥之后再運輸檢測,使生物分析遠(yuǎn)程化[1-2]。DBS法和VAMS法需要聯(lián)合應(yīng)用具有特異性強且靈敏度高等特點的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法來檢測。目前,國內(nèi)外DBS與LC-MS/MS的聯(lián)合技術(shù)(DBS-LC-MS/MS)在新生兒篩查、治療藥物監(jiān)測(TDM)、毒物動力學(xué)和藥代動力學(xué)的臨床應(yīng)用和研究較多[3],而VAMS作為一種較新的技術(shù),在國內(nèi)的研究較少,本文通過介紹VAMS的優(yōu)勢,以及VAMS與LC-MS/MS聯(lián)合技術(shù)(VAMS-LC-MS/MS)的優(yōu)勢和主要應(yīng)用,分析VAMS在國內(nèi)開發(fā)應(yīng)用的潛力和可行性。

1 兩種方法概述

1.1VAMS法 2014年,DENNIFF等[4]發(fā)表了介紹VAMS的相關(guān)論文,VAMS作為一種較新的微量采樣技術(shù)主要用于獲取定量的血液或其他液體生物樣本,并在裝置中干燥后用于生物分析[1,4-5]。有關(guān)VAMS的研究中常用Mitra裝置采樣,Mitra裝置的多孔聚合物尖端利用毛細(xì)管作用可吸收固定體積(10、20 μL或30 μL)的體液,如全血、血清、尿液和唾液等,并與塑料手柄組合便于操作[6]。最具代表性的VAMS裝置是由Neoteryx公司生產(chǎn)的Mitra?裝置,采集血樣時與液面呈45°,利用毛細(xì)血管作用收集定量的樣品于尖端,幾秒(與吸取的樣本體積相關(guān),通常為2～6 s)后裝置尖端充滿、變?yōu)榧t色,結(jié)束采樣,室溫干燥后郵寄給實驗室檢測即可[1,2-4]。VAMS的應(yīng)用廣泛,可用于采集藥物、抗體、金屬元素、興奮劑及生物標(biāo)志物等檢測項目的生物樣品。

1.2DBS法 將指尖或足跟等處穿刺得到的毛細(xì)血管血直接滴在專用的濾紙片上,干燥后截取血斑用于分析的采樣方法稱為DBS法,該方法是一種較成熟的微量采樣技術(shù),臨床中多用于新生兒遺傳性代謝障礙疾病的篩查采血。

1.3VAMS法與DBS法比較 對于定量采集生物樣本,新出現(xiàn)的VAMS法提供了一種替代方法[1-2]。VAMS法作為DBS法的一種替代方法,首先,它們有著共同的優(yōu)勢,如采樣量少、樣品較穩(wěn)定、可非冷藏運輸和適合遠(yuǎn)程采樣。其次,VAMS法有檢測準(zhǔn)確率高的優(yōu)勢:(1)VAMS法能準(zhǔn)確吸收固定體積的樣品,其中Mitra?裝置采集血液具有準(zhǔn)確性和精確性,被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)歸類為1類[7-8]。VAMS裝置可消除DBS法采樣時受到的血細(xì)胞比容(HCT)的影響。HCT指血細(xì)胞在全血中所占的容積百分比,影響血液黏度,從而影響固定體積血樣滴加在濾紙片上的血斑大小,使打孔獲得的血量不固定,檢測結(jié)果發(fā)生偏倚,這是DBS法定量血藥濃度的主要難點[9-10]。(2)提供標(biāo)識。帶有患者條形碼的VAMS裝置可在樣品制備結(jié)束前不被除去,并在制備過程中提供辨認(rèn)樣品的標(biāo)志[8]。最后,VAMS法相較于DBS法存在一定劣勢:(1)每個人操作存在差異,VAMS法的穩(wěn)定性更差,在臨床實踐中,由有經(jīng)驗的采血師從107例腎移植患者中獲得130份匹配的VAMS、DBS末梢血和靜脈全血樣本,經(jīng)過篩選和確認(rèn),有32.3%的VAMS樣品和6.2%的DBS樣品質(zhì)量不佳[11],但是ZIMMERMANN等[12]收集5例腫瘤患者于家庭自行采樣的24份VAMS樣本都采集正確,可能是由于一人只采集1份VAMS樣本會比一定時間內(nèi)為一人采集3種匹配樣本更容易和規(guī)范。因此,患者自己或其家屬經(jīng)過學(xué)習(xí)和大量訓(xùn)練可以解決采樣問題。(2)一個Mitra?裝置的成本高于DBS卡或靜脈穿刺工具包[8]。DBS法與VAMS法共同的采樣優(yōu)點是對患者友好,而VAMS裝置還可以準(zhǔn)確吸收固定體積的樣品,使檢測結(jié)果更準(zhǔn)確,VAMS法作為DBS法的替代采樣方法,有著很好的發(fā)展前景。

2 VAMS和LC-MS/MS技術(shù)聯(lián)合的主要應(yīng)用

LC-MS/MS儀指由色譜技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用的一種檢測裝置,色譜儀用于目標(biāo)檢測物在進(jìn)入質(zhì)譜儀之前的分離和濃縮,提高質(zhì)譜檢測的專一性和靈敏度,質(zhì)譜儀用于鑒定和定量分析分離物,主要結(jié)構(gòu)包括5個部分:樣品導(dǎo)入系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器、檢測器和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)。LC-MS/MS檢測不僅能同時檢測多種物質(zhì)而且靈敏度和準(zhǔn)確度高,被認(rèn)為是在有限體液量中小分子物質(zhì)檢測的金標(biāo)準(zhǔn),如免疫抑制劑和其他窄治療指數(shù)藥物等[8],在臨床可用于TDM、生物標(biāo)志物檢測和新生兒篩查等[13]。

LC-MS/MS檢測用量少和靈敏度高的特點可適用于VAMS技術(shù)的特點,兩者結(jié)合運用于動物實驗、遠(yuǎn)程采樣、兒童采血和其他不宜大量或需短期內(nèi)多次采血的情況。以下主要介紹VAMS技術(shù)在LC-MS/MS各種檢測中的應(yīng)用情況。

2.1動物實驗應(yīng)用 VAMS的設(shè)備采血量少、創(chuàng)傷性小、操作方便,符合動物實驗3R原則(reduction,減少;replacement,替代;refinement,優(yōu)化)。THIRY等[14]利用大鼠實驗開發(fā)驗證伊曲康唑(ITZ)在VAMS法和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法結(jié)合的定量方法。藥物監(jiān)測實驗須在不同的時間點抽取血液樣本,獲得藥代動力學(xué)譜,評估ITZ制劑在大鼠體內(nèi)的生物利用度。實驗利用VAMS設(shè)備,每次收集大鼠尾部全血10 μL(傳統(tǒng)方法需采血0.2～0.5 mL),整個采樣過程為1 min,對動物傷害小,采血量少,可多次采樣,操作簡單,重復(fù)性好。雖然動物實驗數(shù)據(jù)證明利用VAMS法收集少量血液可以減少對動物的傷害,用于藥物濃度、生物標(biāo)志物和金屬元素等監(jiān)測具有可行性,但是實驗中應(yīng)用仍然較少,沒有充足的數(shù)據(jù)證明其沒有誤差,還需要更多的研究優(yōu)化方法和消除VAMS的影響[14-16]。

2.2臨床應(yīng)用 VAMS技術(shù)可采集用于TDM、毒物動力學(xué)和藥代動力學(xué)等研究的多種類型的樣品,以下主要介紹LC-MS/MS與VAMS技術(shù)結(jié)合采集血液樣本進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測的應(yīng)用,這是患者實現(xiàn)遠(yuǎn)程TDM的重要解決方案。

2.2.1免疫抑制劑檢測 移植物治療患者受到自身免疫排斥反應(yīng)的影響,需要服用免疫抑制劑緩解排斥反應(yīng),延長器官使用壽命。因為個體對藥物代謝的差異大,且免疫抑制劑的治療窗口窄,所以患者需要定期到醫(yī)院采集靜脈血進(jìn)行TDM,指導(dǎo)臨床用藥以最小的危害達(dá)到最大的療效[17-18]。目前常用的免疫抑制劑有西羅莫司、他克莫司、依維莫司和環(huán)孢霉素A等,雖然靜脈全血中檢測這4種免疫抑制劑已在臨床應(yīng)用,但是引入VAMS法采集毛細(xì)血管血應(yīng)用于臨床還需要大量的研究及驗證。KOSTER等[10]已開發(fā)并驗證使用VAMS設(shè)備作為取樣裝置采樣,LC-MS/MS法同時定量樣本中他克莫司、西羅莫司、依維莫司、環(huán)孢霉素A和霉酚酸,檢測結(jié)果的準(zhǔn)確率和精密度符合要求且所有分析物可在25 ℃時至少穩(wěn)定14 d,證明VAMS儲存樣品穩(wěn)定,為患者在家中采樣郵寄醫(yī)院檢測提供了解決辦法。研究人員比較了從器官移植患者同時收集VAMS的毛細(xì)血管血和真空管采樣的靜脈全血(檢測患者體內(nèi)的他克莫司血藥濃度),毛細(xì)血管血和靜脈全血結(jié)果具有可比性和一致性,VAMS法采血替代靜脈采血具有可行性[11,17,19]。VAMS與LC-MS/MS技術(shù)聯(lián)合檢測免疫抑制劑結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏、對移植患者傷害小、可實現(xiàn)家中采樣郵寄檢測。

2.2.2抗腫瘤藥物檢測 癌癥是人類死亡的主要原因。癌癥患者可通過注射或口服抗腫瘤藥物抑制腫瘤擴散或惡化,雖然口服抗腫瘤藥物能方便患者的用藥治療,但是由于藥代動力學(xué)的復(fù)雜性和個體差異性使個體血藥濃度差異大,易發(fā)生不可控的不良反應(yīng)。因此,需要TDM控制給藥到最佳治療濃度[20-21]。VERHEIJEN等[22]利用已建立的LC-MS/MS技術(shù)檢測血樣中依維莫司(可用于抗腫瘤和免疫抑制)濃度,準(zhǔn)確度(11.1%)和精密度(≤14.6%)符合要求,在環(huán)境溫度下,樣品在VAMS設(shè)備上穩(wěn)定至少362 d。但是收集的10個臨床用藥患者VAMS的毛細(xì)血管血的檢測結(jié)果高于靜脈全血,需要使用公式計算出全血中的血藥濃度。對于激酶抑制劑類抗腫瘤藥物甲磺酸伊馬替尼、達(dá)沙替尼、吉爾替尼和達(dá)拉法非尼等,研究者利用相應(yīng)計算方法得到血漿、全血及干燥血之間的血藥濃度檢測結(jié)果、轉(zhuǎn)化關(guān)系,顯示在VAMS收集的干燥血與全血和血漿LC-MS/MS檢測有著良好相關(guān)性和一致性[12,23-24]。隨著口服抗腫瘤藥物的TDM的發(fā)展并走向成熟,會推動微量采樣技術(shù)與LC-MS/MS檢測技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用,實現(xiàn)遠(yuǎn)程采樣。

2.2.3其他檢測 精神類藥物在臨床中治療精神疾病也需要TDM,旨在將血藥濃度控制在臨床有用而不造成傷害的范圍內(nèi)[25],如治療精神分裂癥(氯氮平)、抑郁癥(舍曲林、帕羅西汀和西酞普蘭)和癲癇(拉克沙胺、拉莫三嗪和左乙拉西坦)等藥物[26-27]。除了TDM,VAMS與LC-MS/MS技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用還可以檢測生物標(biāo)志物、興奮劑和抗生素等[28-30]。

2.3VAMS技術(shù)在LC-MS/MS法臨床檢測中的前處理 用于LC-MS/MS法檢測之前,VAMS裝置中的樣品需要經(jīng)歷采樣、干燥、運輸、儲存和樣品制備加工等步驟,整個樣品采集、運輸和前處理過程至少需經(jīng)過患者和檢測人員,存在操作偶然性,這就需要通過優(yōu)化VAMS法的使用減少誤差,使兩種技術(shù)聯(lián)用的檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。(1)采樣:采樣的不規(guī)范性可能導(dǎo)致裝置尖端周圍黏上樣品,在樣品未干時VAMS裝置尖端接觸到其他物品表面樣品會丟失一部分,用潮濕或油膩的手指錯誤地接觸VAMS裝置尖端、使液體進(jìn)入裝置占用體積等造成吸樣量偏差等[4]。這些操作上的失誤可以通過對操作者的教學(xué)和培訓(xùn)來減少,如定期操作培訓(xùn)、錄制教學(xué)視頻和公眾號日常推送采樣注意事項等。(2)干燥:裝置內(nèi)的樣品需晾干后檢測和運輸,干燥條件會影響后期樣品的提取。干燥的時間會根據(jù)樣品類型和吸樣量不同而改變,需要避免不當(dāng)干燥和樣品污染。(3)運輸和儲存:運輸過程中由于干燥血中樣品具有穩(wěn)定性一般只需要保存在帶有干燥劑的密封袋中常溫運輸[12,17,24,31-32],樣品長時間無法分析時可用包裝袋形式冷藏保存[31],使樣品穩(wěn)定。(4)樣品制備加工:樣品前處理是兩種技術(shù)聯(lián)用的關(guān)鍵步驟,影響后續(xù)檢測。樣品中檢測物提取純化的主要方法包括液液萃取、蛋白沉淀、固相萃取等[1,3,13]。常用有機溶劑為甲醇和乙腈。YE等[33]對美托洛爾和咪達(dá)唑侖等具有疏水性的模型藥物從VAMS的干燥血樣中的提取回收率進(jìn)行評估,得到高疏水化合物使用單純甲醇或甲醇乙腈混合液萃取的回收率高于甲醇水溶液或乙腈水溶液萃取回收率的結(jié)論。這是因為水會降低有機溶劑的洗脫強度而影響回收率。實際操作中前處理條件不夠完善時,HCT會對VAMS的提取回收率產(chǎn)生影響,HCT與提取回收率呈反比,可能是由于高HCT的大量紅細(xì)胞易堵塞VAMS裝置的尖端孔隙,分析物的提取受阻導(dǎo)致提取回收率下降[34]。因此,選擇合適的提取試劑及萃取分離方法,使VAMS中的樣本完全洗脫和釋放出待測物,提高提取回收率對于提升樣品檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度十分重要。

3 VAMS和LC-MS/MS技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用的優(yōu)勢與挑戰(zhàn)

3.1主要優(yōu)勢 VAMS裝置為LC-MS/MS檢測的項目提供遠(yuǎn)程微量采樣工具,與傳統(tǒng)采樣方法相比,VAMS法可減少TDM、毒物動力學(xué)、藥代動力學(xué)等研究需要多次采樣造成的傷害[3];避免臨床常規(guī)靜脈采血的老人、新生兒及其他不宜大量采血患者的不良反應(yīng);提供有不宜出門(如新型冠狀病毒感染疫情期間)、距離實驗室很遠(yuǎn)和不愿意到醫(yī)院采樣等情況的人群一種方便易學(xué)的采樣方法等。SCUDERI等[35]調(diào)查腎移植患者對靜脈采血和手指末梢采血看法的結(jié)果也顯示,85%的參與者更喜歡手指采血,95%的參與者對在家中手指采血感興趣,可以看出大部分腎移植患者愿意接受末梢采血代替靜脈采血,末梢采血的VAMS法在患者中推行具有優(yōu)勢和可行性。LC-MS/MS法除了具有高通量、靈敏度和準(zhǔn)確度高,可對痕量物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析,單次檢測樣品量小,可低至幾微升,還具有特異性和選擇性強的特點,能避免如免疫學(xué)方法在檢測中受到的交叉反應(yīng)等干擾,VAMS-LC-MS/MS法檢測復(fù)雜末梢血中的微量樣品具有高度適配性。

3.2主要挑戰(zhàn) 雖然兩種技術(shù)具有獨特的優(yōu)勢,但是在它們的聯(lián)合應(yīng)用中會遇到很多挑戰(zhàn)和亟待解決的問題:VAMS法前處理的復(fù)雜性,LC-MS/MS法的自動化程度低、儀器復(fù)雜,需要專業(yè)的培訓(xùn)人員操作和維護(hù),不同的操作人員操作時會有一定的不確定性,實驗檢測結(jié)果不可控的因素較多等。因此需要做好質(zhì)量控制和不斷優(yōu)化檢測方法。而且LC-MS/MS法在臨床檢驗中大多數(shù)實驗室需要自行建立方法和進(jìn)行方法學(xué)驗證,相關(guān)的實驗室指南較少,因此存在標(biāo)準(zhǔn)化困難等。這些問題都阻礙了兩種技術(shù)在臨床實驗室聯(lián)合應(yīng)用的發(fā)展。

4 展 望

VAMS法的前處理對樣品檢測結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確率影響大,可以通過臨床VAMS的樣品從前處理到LC-MS/MS法檢測的全自動化來解決,消除因為操作不同帶來的誤差,而且可隨時插入樣本檢測,提高檢測效率和準(zhǔn)確率。VAMS法在門診和遠(yuǎn)程采樣中應(yīng)用可以使短時間內(nèi)多次靜脈采血患者受到的傷害和恐懼等減少,使就診變得更加自由、靈活和方便。VAMS-LC-MS/MS技術(shù)的發(fā)展是個體化治療和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要部分。微創(chuàng)、采樣量少、患者接受度高和運輸方便的VAMS技術(shù)與高靈敏度的LC-MS/MS技術(shù)結(jié)合應(yīng)積極研究和推廣,這不僅能為部分患者減輕就診負(fù)擔(dān)、實現(xiàn)遠(yuǎn)程診斷,還能為偏遠(yuǎn)地區(qū)人群取樣和動物實驗等提供方便。