狗棗獼猴桃多酚提取物對小鼠的抗疲勞作用

劉詩宇,王鈺涓,張 威,王 巧,左麗麗

(吉林醫藥學院公共衛生學院,吉林 吉林 132013)

疲勞是由于大腦或體力衰竭而引起的機體一種復雜的生理和生物現象,同時也是當今社會普遍存在的健康問題[1]。隨著社會經濟的不斷發展和人們生活節奏的日益加快,越來越多的人容易出現疲勞的癥狀。疲勞使體內器官產生生理性變化,不能維持器官的正常工作,會造成機體免疫力下降甚至產生疾病[2-4]。同時,疲勞也會使人精力不集中,造成工作效率下降[5,6],甚至導致衰老、抑郁、癌癥和帕金森癥等多種疾病[7-9]。目前,藥物治療是延緩疲勞癥狀的主流選擇,但長期用藥可能會產生嚴重的毒副作用[10]。因此,探尋安全、健康、有效的天然抗疲勞活性成分受到越來越多國內外學者的廣泛關注。

目前,國內外已有許多關于食物中活性物質的抗疲勞作用研究[11-13]。研究發現,茶多酚可以緩解運動員運動過程中和高強度訓練后肌肉的疲勞感[14]。多酚在一定程度上還具有提高機體運動耐力和耐缺氧能力、抗疲勞等多種功效[15,16]。狗棗獼猴桃(Actinidiakolomikta)為獼猴桃科獼猴桃屬的落葉藤本植物,是廣泛分布于東北地區的野生獼猴桃品種之一,也是東北大興安嶺、長白山地區極具經濟價值的小漿果植物[17-19]。前期研究發現,狗棗獼猴桃果實中含有豐富的多酚物質和其他活性成分,具有一定的抗腫瘤、抗輻射和抗衰老等功能[20],而關于狗棗獼猴桃多酚活性成分抗疲勞相關的研究較少。因此,本試驗擬研究狗棗獼猴桃多酚提取物(Actinidiakolomiktapolyphenols extract,APE)對小鼠疲勞的緩解作用,為狗棗獼猴桃抗疲勞功能食品的開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 狗棗獼猴桃多酚提取物(APE,純度為48.6%),由吉林醫藥學院慢病實驗中心實驗室制備;清潔級雄性ICR小鼠,6～8周齡,體重(22±2)g,生產許可證號:SCXK(吉)2015—0005,購于長春市億斯實驗動物技術有限責任公司;乳酸(Lactic acid,LD,批號20201102)檢測試劑盒、肝/肌糖原(Hepatic/muscle glycogen,HG/MG,批號20201026)檢測試劑盒、尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN,批號20201026)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD,批號20201024)檢測試劑盒、丙二醛(Malondialdehyde,MDA,批號20201024)檢測試劑盒和還原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH,批號20201026)試劑盒,均購于南京建成生物工程研究所。

1.2 主要儀器 低速離心機(TDZ4-WS),湖南湘儀實驗儀器有限公司產品;旋轉蒸發儀(RE-3000),上海亞榮生化儀器廠產品;凍干機(FDU-2110),日本EYELA東京理化器械株式會社產品;酶標儀(HT-2),Biocell公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 狗棗獼猴桃多酚的分離純化 挑選一定量新鮮狗棗獼猴桃漿果,使用料理機將其粉碎打漿,用60%的乙醇按照1∶3的料液比,45 ℃超聲30 min提取其中的多酚類成分,離心收集上清,殘渣用同樣方法重復提取3次,合并提取液,減壓濃縮至一定體積,并通過AB-8大孔樹脂進行純化,收集洗脫液并將其濃縮后凍干,采用福林酚測定其多酚含量,凍干粉保存于-20 ℃冰箱,備用。

1.3.2 小鼠的分組和給藥 60只ICR雄性小鼠在溫度18～22 ℃、相對濕度40%～70%的條件下適應性飼養1周后用于試驗。將小鼠隨機分為6個組:空白對照組、疲勞模型組、茶多酚對照組[30 mg/(kg·bw·d)茶多酚]、狗棗獼猴桃多酚低[25 mg/(kg·bw·d)]、中[50 mg/(kg·bw·d)]和高劑量組[100 mg/(kg·bw·d)],每組10只,使用苦味酸將其進行組內和組間標記,藥物組每天按時灌胃1次,空白對照組和疲勞模型組每日對小鼠灌胃與藥物組等體積的生理鹽水,連續灌胃15 d。

1.3.3 小鼠負重游泳試驗 試驗小鼠連續灌胃給藥15 d后,從每組中隨機抽取3只小鼠進行負重游泳試驗。即在末次給藥后30 min,在不影響小鼠游泳的前提下,按照5%小鼠體重計算,將一定質量的錫絲捆綁在小鼠尾部,將其置于游泳缸[水溫為(25±1) ℃、深度為30 cm]中進行游泳,記錄小鼠自游泳開始至其力竭游泳的時間,保持小鼠頭部沉入水中10 s后不能自行游出水面進行呼吸,即為其力竭游泳時間[21]。

1.3.4 小鼠不負重游泳試驗和取材 取材前小鼠禁食給水12 h。將小鼠置于水溫為(25±1)℃的游泳缸中不負重游泳90 min后,將其撈出擦干,置于室溫環境中休息30 min后,摘眼球取血,4 ℃條件下3 000 r/min離心10～15 min,取上清液快速分離血清,做好標記并保存于-80 ℃冰箱備用。頸椎脫臼處死小鼠,快速分離小鼠肝臟和骨骼肌組織,同時使用生理鹽水將組織清洗數次,去除血污并清理干凈結締組織,用濾紙吸干組織表面多余的水分,標記后放置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.3.5 小鼠體內生化指標的測定 采用試劑盒檢測小鼠血清中BUN和LD含量,肝組織中HG、MDA、GSH含量和SOD活力,肌肉組織中MG含量,嚴格按照試劑盒說明書方法進行檢測。

1.4 統計與分析 數據結果以“平均值±標準差”表示,通過SPSS 19.0統計軟件進行數據分析,各組間均數比較采用單因素方差分析,同時采用Origin 9.1軟件進行做圖分析。

2 結果

2.1 APE對小鼠負重游泳時間的影響 如圖1所示,與疲勞模型組相比較,狗棗獼猴桃多酚低和中劑量組小鼠的負重游泳時間變化沒有統計學意義(P>0.05),而高劑量組和茶多酚對照組小鼠負重游泳時間極顯著延長(P<0.01),狗棗獼猴桃多酚高劑量組小鼠負重游泳時間達到(30.31±5.91)min,比疲勞模型組提高了66.49%,與茶多酚對照組小鼠的負重游泳時間[(31.15±5.21)min]相當。即一定劑量的APE能延長小鼠負重游泳時間,并提高小鼠疲勞的耐受性,緩解小鼠疲勞。

圖1 狗棗獼猴桃多酚提取物對小鼠負重游泳時間的影響Fig.1 Effects of Actinidia kolomikta polyphenols extract on the exhaustive swimming time of mice與疲勞模型組相比,**P<0.01Compared with Fatigue model group,**:P<0.01

2.2 APE對疲勞小鼠血清BUN含量的影響 如圖2所示,與空白對照組相比,疲勞模型組小鼠血清BUN含量上升了12.18%(P<0.05)。干預一段時間后,與疲勞模型組進行比較,狗棗獼猴桃多酚中和高劑量組小鼠血清BUN含量均有所下降(P<0.05或P<0.01),茶多酚對照組、狗棗獼猴桃多酚中和高劑量組小鼠血清BUN含量分別下降了8.53%、11.56%和14.20%,表明體內能源物質供給相對比較充足,能夠滿足機體需要,從而蛋白質和氨基酸分解代謝減少,即APE干預可顯著降低小鼠運動后血清BUN含量。

圖2 狗棗獼猴桃多酚提取物對疲勞小鼠血清尿素氮含量的影響Fig.2 Effects of Actinidia kolomikta polyphenols extract on serum BUN content in fatigue mice與空白對照組相比,#:P<0.05,##:P<0.01; 與疲勞模型組相比,*:P<0.05,**:P<0.01; 下同Compared with the Blank control group,#:P<0.05,##:P<0.01; Compared with the Fatigue model group,*:P<0.05,**:P<0.01. The same as below

2.3 APE對疲勞小鼠血清LD含量的影響 運動后會導致機體產生大量乳酸,乳酸大量積累會導致機體產生疲勞。如圖3所示,與空白對照組相比,疲勞模型組小鼠血清LD含量極顯著上升(P<0.01),達到(11.58±0.77) mmol/L。干預一段時間后,與疲勞模型組相比,給藥組血清LD含量均出現不同程度的下降,狗棗獼猴桃多酚提取物低、中、高劑量組和茶多酚對照組小鼠血清LD含量分別降低了8.81%、20.47%、55.22%和30.48%(P<0.05或P<0.01),表明APE可以有效清除機體高強度運動過程中代謝產生的乳酸。

圖3 狗棗獼猴桃多酚提取物對疲勞小鼠血清乳酸含量的影響Fig.3 Effects of Actinidia kolomikta polyphenols extract on serum LD content in fatigue mice

2.4 APE對疲勞小鼠HG和MG含量的影響 機體的運動耐力與體內糖原含量的多少存在著直接關系[22]。與空白對照組相比,疲勞模型組小鼠MG含量下降了40.04%(P<0.01),表明運動導致小鼠消耗大量的能源物質,代謝物質不斷積累,最終使小鼠產生運動性疲勞。干預一段時間后,與疲勞模型組相比,狗棗獼猴桃多酚低、中、高劑量組和茶多酚對照組小鼠體內MG含量分別提高了34.16%、40.32%、94.78%和117.00%(P<0.01)(圖4A),即APE使得小鼠體內MG分解減少,儲備增加,節省糖原的利用,從而使得機體運動能力得到有效提高。同時,與空白對照組相比,疲勞模型組小鼠體內HG含量降低了57.5%(P<0.01),HG分解為機體提供一定的能量,隨著運動時間進一步延長,HG不斷被消耗,其儲備量隨之減少。與疲勞模型組相比,狗棗獼猴桃多酚提取物低、中、高劑量組和茶多酚對照組疲勞小鼠體內HG含量分別上升了25.46%(P>0.05)、33.26%、54.26%和293.84%(P<0.05或P<0.01)(圖4B),表明APE能夠增加糖原儲備量,減少運動中能源消耗,從而提高運動耐力,改善運動型疲勞。

圖4 狗棗獼猴桃多酚提取物對疲勞小鼠肌糖原(A)和肝糖原(B)含量的影響Fig.4 Effects of Actinidia kolomikta polyphenols extract on MG(A) and HG(B) content in fatigue mice

2.5 APE對疲勞小鼠肝臟SOD活力的影響 SOD是一類廣泛存在于機體各種組織細胞內的抗氧化金屬酶,其作用主要是清除體內多余的超氧陰離子自由基。如圖5所示,與空白對照組相比,疲勞模型組小鼠肝臟中SOD活力下降至(206.61±8.62) U/mgprot(P>0.05)。干預一段時間后,與疲勞模型組相比,低、中、高劑量的狗棗獼猴桃多酚提取物使疲勞小鼠肝臟SOD活力分別提高了38.80%、44.41%和87.48%(P<0.01),且呈現一定的劑量依賴關系;茶多酚對照組小鼠肝臟SOD活力也有所提高,但差異不顯著(P>0.05),提示APE能夠提高疲勞小鼠體內SOD活力,增強機體抗氧化能力,從而進一步發揮其對小鼠的抗疲勞作用。

圖5 狗棗獼猴桃多酚提取物對疲勞小鼠肝組織超氧化物歧化酶活力的影響Fig.5 Effects of Actinidia kolomikta polyphenols extract on SOD activity of liver in fatigue mice

2.6 APE對疲勞小鼠肝臟MDA含量的影響 MDA的含量是反映機體抗氧化能力的重要指標之一,其主要反映機體發生脂質過氧化反應的速率,同時也進一步反映細胞膜受到損傷的程度,機體中MDA含量越高,說明細胞受到的損傷越嚴重。如圖6所示,與空白對照組相比,疲勞模型組小鼠肝臟中MDA含量顯著升高了30.0%(P<0.01)。干預一段時間后,疲勞小鼠肝臟中MDA含量逐漸下降,尤其是高劑量的狗棗獼猴桃多酚提取物使小鼠體內MDA含量下降了23.24%(P<0.01),達到空白對照組水平,表明一定劑量的APE對疲勞誘發的機體氧化損傷起到一定程度的保護作用。

圖6 狗棗獼猴桃多酚提取物對疲勞小鼠肝臟MDA含量的影響Fig.6 Effects of Actinidia kolomikta polyphenols extract on MDA content of liver in fatigue mice

2.7 APE對疲勞小鼠肝臟GSH含量的影響 GSH是體內低分子量的自由基清除劑,具有一定的抗氧化和抗衰老作用。如圖7所示,與空白對照組相比,疲勞模型組小鼠肝臟中GSH含量下降了15.33%(P>0.05)。干預一段時間后,茶多酚和低、中、高劑量的狗棗獼猴桃多酚提取物使疲勞小鼠肝臟中GSH含量分別升高了19.29%(P>0.05)、44.88%、53.94%和66.14%(P<0.05或P<0.01),且呈現出一定的劑量依賴關系,即APE能夠提高疲勞小鼠體內GSH含量,從而顯示出一定的抗疲勞效果。

圖7 狗棗獼猴桃多酚提取物對疲勞小鼠肝臟中還原型谷胱甘肽含量的影響Fig.7 Effects of Actinidia kolomikta polyphenols on GSH content of liver in fatigue mice

3 討論

本試驗通過構建疲勞小鼠模型,分析APE的抗疲勞作用。機體運動時,肌肉發生收縮會消耗體內的糖原從而維持血糖水平,并為肌肉活動提供一定的能量,有效延緩疲勞的產生[23]。HG和MG是機體中糖的儲能形式,其在機體需要能量時會發生分解產生葡萄糖,其中MG直接為運動提供一定的能量,所以體內MG的含量與機體的運動耐力呈正比關系[24,25]。本試驗結果表明,APE能夠有效降低運動引起的HG和MG的消耗,使得體內HG和MG等能源物質的含量有一定程度增加,從而大大延緩疲勞的產生,小鼠游泳耐力得到增強,負重游泳力竭時間顯著延長,與陳蓉等[26]和Peng等[27]的研究結果一致。

有研究表明,短時間內進行高強度的運動,對氧的需求量大,會導致氧的供應量缺乏,增加糖原代謝,使血清中的代謝產物如LD和BUN等不斷增加,進一步引起肌肉收縮效率下降,最終導致體力衰竭[28]。BUN是機體中蛋白質和氨基酸等物質代謝的主要終末產物,是具有代表性的疲勞生化指標[29]。本試驗中疲勞模型組小鼠血清BUN含量顯著上升,提示糖類和脂肪等物質的分解代謝產生的能量已不能滿足機體運動所需,此時需要蛋白質分解代謝為機體補充一定的能量,導致血清BUN含量有所增加,BUN積累導致肌肉收縮力下降并誘發疲勞[30]。同時,隨著運動強度的加劇,體內氧氣供給不足,肌肉開啟無氧方式提供能量,隨之使機體產生大量LD,LD堆積到一定程度后會引起神經傳導、糖酵解和肌肉收縮等生物過程障礙,致使機體產生疲勞[31]。本試驗結果表明,APE可在一定程度上減少機體運動后血清中LD和BUN等代謝產物的含量,使得機體能量代謝得到改善,從而對抗運動性疲勞,而狗棗獼猴桃多酚低劑量組BUN下調效果不理想,可能是由于個體差異導致的。有研究顯示,多酚類物質能夠提高機體乳酸脫氫酶的活力,并使運動后LD水平降低[32,33],從而有效避免代謝產物堆積對機體產生的傷害,提高機體適應高強度運動的能力和抗疲勞的能力。因此,狗棗獼猴桃多酚和茶多酚均可能是通過調節乳酸脫氫酶的活力從而有效抑制運動后LD的積累和生成,進一步緩解血LD在體內的堆積,從而延緩體力疲勞的程度。

研究顯示,劇烈運動可導致機體活性氧產生加速,體內氧自由基和自由基清除系統平衡被打破,導致機體產生氧化應激損傷,降低體內抗氧化物酶的活力[34,35]。本試驗結果顯示,APE通過提高機體SOD活力并降低MDA含量來抑制運動誘導的氧化應激。

綜上所述,APE表現出一定的抗疲勞作用,其作用機制可能是增加能量儲備、抑制氧化應激并及時消除疲勞產生的代謝產物。因此,可以進一步從抗氧化、能量代謝和分子生物學等方面開展深入研究,以期為新型抗疲勞功能性食品的開發利用提供一定的科學依據。