復方功應草的急性和亞慢性毒性試驗

張宜諾,凌 浩,顏 倩,孫樂樂,趙 莉,曾建國

(1.湖南農業大學動物醫學院,湖南 長沙 410128 ; 2. 青島農業大學化學與藥學院,山東 青島 266109)

復方功應草是由十大功勞、救必應、老鸛草、苦參和鐵莧菜等藥材經提取加工而成,具有清熱解毒、燥濕止痢的功效,主要用于治療大腸桿菌感染引起的仔豬濕熱瀉痢。為了評價和考察復方功應草的安全性,本試驗根據《獸用化學中藥研究技術指導原則匯編(2022年)》[1]和農業部1247號公告《獸藥30天和90天喂養試驗指導原則》[2],并參考《中藥藥理實驗方法學》[3]和《藥理實驗方法學》[4]進行復方功應草的小鼠經口急性毒性試驗和大鼠經口給藥30 d的亞慢性毒性試驗研究,以期為復方功應草的臨床應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 受試藥物 復方功應草粉末(批號為20220601,100 g/袋,1.4 g原生藥可以制成1 g復方功應草粉末),實驗室自制。藥材提取方式:稱取處方量的藥材,加12倍量水煎煮1.5 h,濾過,藥渣再加10倍量水煎煮1.5 h,水煎液濾過,合并,減壓濃縮為相對密度為1.10～1.15的浸膏,噴霧干燥,粉碎成細粉,加無水葡萄糖調整總量至1 000 g,混勻,分裝,即得。

1.2 實驗動物 SPF級ICR小鼠48只,雌雄各半,體重18～22 g;4周齡SPF級SD大鼠80只,雌雄各半,體重90～120 g,均購于青島市實驗動物和動物實驗中心[生產許可證號:SCXK(魯)2022—0001]。

1.3 主要儀器 血常規管(批號20220102)、分離膠管(批號20220903),江蘇宇力醫療器械有限公司產品;電子天平(型號SL302 N),上海民橋精密科學儀器有限公司產品;自動血球分析儀(型號XT-2000iv),日本希森美康東亞株式會社產品;日立全自動生化分析儀(型號7180ISE),日本日立高新技術株式會社產品;高速離心機(型號universal 320R),德國Hettich產品。

1.4 小鼠急性毒性試驗

1.4.1 預試驗 將8只ICR小鼠按照體重隨機分成受試藥物組和空白對照組2個組,每組4只小鼠(雌雄各半),灌胃前禁食不禁水12 h。受試藥物組小鼠灌服復方功應草藥液,每日1次,灌胃給藥體積為0.2 mL/(10 g·bw),相當于10 g/(kg·bw)復方功應草;空白對照組灌服等量生理鹽水。給藥后4 h內連續觀察記錄2個組小鼠的表現,之后每日正常采食和飲水,上下午各觀察1次小鼠表現,是否出現明顯的毒副作用或死亡,連續觀察7 d[5]。隨后,將每組小鼠數量增加至10只(雌雄各半),試驗方法同上,觀察2個組小鼠是否出現明顯的毒副作用或死亡。如果受試藥物組的小鼠全部存活,未能測出復方功應草的半數致死量(Median lethal dose,LD50)值,說明該受試藥物毒性很低,可按照《中藥、天然藥物急性毒性研究技術指導原則》[6]進行最大給藥劑量試驗。

1.4.2 一天多次最大給藥劑量試驗 將20只ICR小鼠,按照體重隨機分為受試藥物組和空白對照組2個組,每組10只,雌雄各半,試驗前禁食不禁水12 h。受試藥物組小鼠灌胃給予復方功應草3次,每次間隔時間為3 h,每次灌胃體積為0.2 mL/(10 g·bw),3次合并灌胃劑量達到0.6 mL/(10 g·bw),即復方功應草給藥劑量達到30 g/(kg·bw);空白對照組灌服等量生理鹽水。給藥后4 h內連續觀察并記錄小鼠表現,之后每日上下午各觀察記錄1次小鼠表現,連續觀察7 d。觀察內容包括呼吸、精神狀態、采食、飲水和二便等一般狀態,并詳細記錄動物的中毒表現和特點,毒性反應發生和消失時間,小鼠死亡時間,觀察期結束后脫臼處死所有存活小鼠,進行眼觀病理學檢查[7]。

1.5 大鼠亞慢性毒性試驗

1.5.1 試驗分組和給藥 根據《獸藥30天和90天喂養試驗指導原則》[2],將80只健康SD大鼠隨機分為4個組,每組20只,雌雄各半。稱重后,將復方功應草隨機分配到3個試驗組,即復方功應草高劑量組、中劑量組和低劑量組大鼠分別給予17.4、8.5和1.7 g/(kg·bw)的復方功應草,空白對照組以生理鹽水灌胃,每天1次,連續30 d。

1.5.2 臨床觀察和檢測

1.5.2.1 一般行為表現觀察 試驗期間每日觀察大鼠的精神狀態、營養狀況、采食、飲水、運動行為、被毛、糞便和尿液等一般行為表現[8]。

1.5.2.2 體重、采食量和飲水量統計 所有大鼠每周稱量1次體重和采食量,每天記錄1次飲水量,計算每只大鼠每周的平均體重、平均采食量和平均飲水量。

1.5.2.3 血液學指標和血液生化指標檢測 停藥后24 h,各組分別取5只雄性和5只雌性大鼠,用水合氯醛[劑量為400 mg/(kg·bw)]進行麻醉,采血檢查血液學和血液生化指標。

1.5.2.4 大體剖檢病變觀察和臟器系數測定 處死大鼠后,各組分別取5只雄性和5只雌性大鼠,摘取心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、胃腸、睪丸或卵巢,觀察病變并稱重,按照公式(1)計算臟器系數。

臟器系數=臟器重量(g)÷體重(g)×100

(1)

1.5.2.5 組織病理學檢查 大鼠采血后及時處死,每組分別采集心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、胃腸、睪丸或卵巢,立即保存于10%福爾馬林溶液內固定,制作石蠟切片,經蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,H.E.)染色對高劑量組和空白對照組大鼠各主要器官進行組織病理學檢查,如發現病變,分別檢查中、低劑量組大鼠的相應器官和組織[9]。

2 結果

2.1 小鼠急性毒性試驗

2.1.1 預試驗 復方功應草以10 g/(kg·bw)劑量經口灌服后,7 d內小鼠未見毒副作用和死亡,證明復方功應草屬于實際無毒物質。

2.1.2 一天多次最大給藥劑量試驗 ICR小鼠單次給藥劑量為10 g/(kg·bw),1 d內連續給藥3次,使用劑量合并達到30 g/(kg·bw),7 d內所有小鼠均存活,且精神、采食、飲水和排便等正常,未出現中毒反應。觀察期結束后處死存活小鼠,眼觀病理學檢查均未發現明顯可見的病理變化。結果表明,小鼠以30 g/(kg·bw)劑量灌服復方功應草,無明顯毒副作用,該劑量相當于大鼠以13.74 g/(kg·bw)劑量灌服,根據化學物急性毒性劑量分級表的規定,口服劑量介于5 001～15 000 mg/(kg·bw)屬實際無毒[1]。

2.2 大鼠亞慢性毒性試驗

2.2.1 一般行為表現觀察 整個試驗期間各組大鼠均沒有出現任何異常現象,大鼠的精神狀態、營養狀況、被毛、行為表現、飲食和二便等一般行為表現均正常,無中毒和死亡情況。

2.2.2 體重統計 如表1所示,試驗期間每周稱量每組大鼠的體重,數據分析結果顯示,與空白對照組相比,低劑量組、中劑量組和高劑量組每只大鼠的每周平均體重均無顯著差異(P>0.05)。

表1 復方功應草對大鼠每周平均體重的影響Table 1 Effect of Compound Gongying Cao on average weekly body weight of rats

2.2.3 采食量統計 如表2所示,試驗期間每周記錄每籠大鼠的采食量,以周為單位進行統計,數據分析結果顯示,與空白對照組相比,低劑量組、中劑量組和高劑量組每只大鼠的每周平均采食量均無顯著差異(P>0.05)。

表2 復方功應草對大鼠每周平均采食量的影響Table 2 Effect of Compound Gongying Cao on average weekly feed intake of rats [g/(只·周),n=10]

2.2.4 飲水量統計 如表3所示,試驗期間每天記錄大鼠的飲水量,以周為單位進行統計,數據分析結果顯示,與空白對照組相比,低劑量組、中劑量組和高劑量組每只大鼠的平均飲水量均無顯著差異(P>0.05)。

表3 復方功應草對大鼠平均飲水量的影響Table 3 Effect of Compound Gongying Cao on water intake of rats [mL/(只·天),n=10]

2.2.5 血液學指標和血液生化指標檢測 停藥24 h后,每組隨機抽取10只大鼠(雌雄各半)進行血液學指標和血液生化指標檢測,數據分析結果如表4和表5所示,與空白對照組相比,低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠各血液學指標和血液生化指標檢測結果無顯著差異(P>0.05),表明復方功應草對大鼠的血液學指標和血液生化指標無不良影響。

表4 復方功應草對大鼠血液學指標的影響Table 4 Effect of Compound Gongying Cao on hematological parameters of rats

表5 復方功應草對大鼠血液生化指標的影響Table 5 Effect of Compound Gongying Cao on blood biochemical parameters of rats

2.2.6 大體剖檢病變觀察和臟器系數測定 試驗結束后,每組隨機抽取10只大鼠(雌雄各半),稱重,剖殺,進行大體剖檢觀察,結果顯示,各組大鼠均未發生眼觀病變,主要臟器的大小和色澤均無異常,也無腫脹、出血或壞死等病變。統計分析心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、胃腸、睪丸或卵巢的臟器系數,結果如表6所示,與空白對照組相比,低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠各臟器系數均無顯著差異(P>0.05),表明復方功應草對大鼠臟器組織無不良影響。

表6 復方功應草對大鼠臟器系數的影響Table 6 Effect of Compound Gongying Cao on organ coefficients of rats

2.2.7 組織病理學檢查 采血后,處死各組大鼠,將各組大鼠的心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、胃腸、睪丸或卵巢分別用10%福爾馬林溶液固定,制作石蠟組織切片,H.E.染色后經顯微鏡觀察,結果如圖1所示,與空白對照組相比,高劑量組大鼠的上述臟器沒有出現瘀血、出血、變性、壞死和炎癥等病理性變化,即高劑量復方功應草未給大鼠造成病理組織學損傷。

3 討論

3.1 復方供應草的急性毒性試驗 復方供應草是以主要成分為十大功勞、救必應、老鸛草、苦參和鐵莧菜等中藥制得的中藥復方散劑,其成分無毒,相互之間不存在“十八反,十九畏”等相關配伍禁忌。

李燕婧等[10]對長柱十大功勞水提物進行急性毒性研究,結果顯示,長柱十大功勞水提物的最大給藥量為402.00 g/(kg·bw),毒性很低;徐春生等[11]進行了救必應提取物的急性毒性試驗,結果顯示,按照急性毒性數據分級,救必應提取物屬實際無毒級物質;崔穎等[12]通過老鸛草乙醇提取物的急性毒性試驗,得到昆明系小鼠灌服老鸛草乙醇提取物劑量達到30 g/(kg·bw)時,其精神和活動等未見異常,說明小鼠的最大耐受量大于30 g/(kg·bw)(相當于750 g/kg生藥材),可以判定老鸛草乙醇提取物屬于實際無毒物質。急性毒性試驗是為了觀察給藥后動物的毒性反應和死亡情況,在1 d內一次性或多次給藥的試驗方法[13]。急性毒性試驗是評價藥物安全性的重要指標,其結果為后續的亞慢性毒性試驗提供理論基礎[14]。在復方供應草的急性毒性試驗的預試驗中,復方功應草的給藥劑量達到10 g/(kg·bw)時,小鼠未見毒副作用和死亡;一天多次最大給藥劑量試驗中,給藥劑量合并達到30 g/(kg·bw)時,連續觀察7 d,所有小鼠均存活,且精神、采食、飲水和排便等均正常,未出現中毒反應或死亡的情況。

3.2 復方供應草的亞慢性毒性試驗 亞慢性毒性試驗是評價藥物臨床應用前安全性的重要部分,本試驗對復方供應草進行了30 d的亞慢性毒性試驗,試驗設置復方供應草高劑量組[17.4 g/(kg·bw)]、中劑量組[8.5 g/(kg·bw)]、低劑量組[1.7 g/(kg·bw)]和空白對照組,考察長期使用不同劑量的復方供應草是否會產生毒副作用、對組織器官造成一定損失以及影響其他臨床評價指標[15,16]。結果顯示,大鼠長期服用復方供應草均未出現任何異常現象,大鼠的精神狀態、營養狀況、皮毛、行為表現、飲食和二便等一般行為表現各項指標均正常,無中毒和死亡情況;復方功應草的3個劑量組大鼠的每周平均體重、采食量和飲水量與空白對照組均無明顯差異(P>0.05),表明復方功應草對大鼠體重、采食量和飲水量無不良影響。

血液學指標、血液生化指標和臟器系數是評價藥物毒性的常用指標,可在一定程度上反應該藥物對動物臟器的影響程度[17-19]。徐春生等[20]進行了救必應提取物的安全性研究,結果顯示,救必應提取物在經口反復接觸時是安全的。本試驗結果顯示,復方供應草低、中、高3個劑量組大鼠的血液學指標、血液生化指標和臟器系數與空白對照組無顯著差異(P>0.05),表明復方功應草對大鼠血液學指標、血液生化指標和臟器組織無不良影響。

組織病理學檢查是目前臨床醫學領域常用的一種診斷方式[21]。秦哲等[22]對野老鸛草乙醇提取物的亞慢性毒性作用進行了初步研究,結果顯示,給大白鼠灌服野老鶴草乙醇提取物對大白鼠的主要臟器沒有產生明顯毒性作用和病理性損害。本試驗對復方供應草高劑量組和空白對照組大鼠的主要器官組織進行病理學檢查均未發現異常,經顯微鏡觀察,沒有發現壞死、炎癥等病理性變化,表明受試藥物復方功應草有較高的安全性,無亞慢性毒性。

4 結論

綜上所述,小鼠經口染毒,LD50大于10 g/(kg·bw),連續3次經口染毒累積劑量達到30 g/(kg·bw),小鼠無明顯中毒反應,證明復方功應草屬實際無毒。復方功應草按照高[17.4 g/(kg·bw)]、中[8.5 g/(kg·bw)]和低[1.7 g/(kg·bw)]3個劑量給大鼠灌胃,每日1次,連用30 d,對受試大鼠的體重、采食、飲水和一般行為均無不良影響;對血液學指標、血液生化指標和主要器官的臟器系數無不良影響;對高劑量組大鼠的主要臟器組織病理學檢查未發現異常,復方功應草對主要器官無不良影響,表明在30 d內受試藥物復方功應草有較高的臨床用藥安全性。