新型狂犬病疫苗的研究進展

王運航,王田田,張雅雅,米耀云,黃 艷,李河林,郭慧琛,敬曉棋

(1. 榆林學院生命科學學院,陜西 榆林 719000 ; 2. 中國農業科學院蘭州獸醫研究所,甘肅 蘭州 730046 ; 3. 榆林市榆陽區動物疫病預防控制中心,陜西 榆林 719000)

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引起的急性、高度致死性的烈性人獸共患病[1],因其分布廣泛、病死率極高,受到了廣泛關注。據統計,全球每年有約59 000人因狂犬病導致死亡,其中亞洲和非洲地區為狂犬病的重災區[2]。因此,暴露前的疫苗接種就顯的尤為重要,但傳統狂犬病疫苗仍存在單次免疫抗體水平低、維持時間短、生產成本高等問題,而針對人類、寵物和野生動物3個群體開發安全性高、副作用低、免疫效果優的新型疫苗,不但能解決傳統狂犬病疫苗所存在的問題,同時也是實現世界衛生組織(World Health Organization,WHO)2030年消除人間狂犬病目標的關鍵手段。

1 傳統狂犬病疫苗

傳統狂犬病疫苗的發展已經歷了3個階段:動物神經組織疫苗、禽胚疫苗和細胞培養疫苗。動物神經組織疫苗是在19世紀80年代,由法國微生物學家巴斯德利用動物的中樞神經組織制備而成的狂犬病減毒疫苗,但該疫苗存在效力差、需要多劑量給藥并伴有嚴重的不良反應等問題[3],如引發過敏性腦脊髓炎和其他神經組織并發癥,易導致癱瘓和死亡等不良后果[4]。目前,WHO已建議不在臨床中使用該疫苗。第2階段為禽胚疫苗,如鴨胚疫苗(Duck embryo vaccine,DEV)和純化鴨胚疫苗(Purified duck embryo vaccine,PDEV)等。DEV是將狂犬病病毒接種于適齡鴨胚的卵黃囊中進行培養,培養結束后提取病毒并將其上清液加以提純和濃縮制備而成的狂犬病滅活疫苗[5]。與神經組織疫苗類似,禽胚疫苗也存在不良反應率高、免疫保護率低等問題,因此未得到推廣應用[6]。第3階段則為細胞培養疫苗,也是目前廣泛應用的狂犬病滅活疫苗,如精制Vero細胞疫苗[7]和人二倍體細胞疫苗[8]等。此類疫苗具有副作用小、產生中和抗體快的優勢,但卻不能有效激活機體的細胞免疫,因此需要多次接種才能獲得理想的免疫效果。

目前,我國人用的傳統狂犬病疫苗以細胞培養疫苗為主(表1),但其存在生產工藝復雜、需多次免疫(4～5針)、免疫程序繁瑣和佐劑輔助才能產生免疫效果等不足[9]。因此,研發安全性高、只需單次免疫的狂犬病疫苗是狂犬病疫苗未來的發展方向。

表1 我國人常用傳統狂犬病疫苗信息Table 1 Information on traditional rabies vaccines commonly used in China

2 新型狂犬病疫苗研究進展

2.1 活載體疫苗 活載體疫苗是將免疫原基因與載體連接的重組載體轉入受體,獲得增殖培養物供疫苗制備,或直接將活載體接種宿主,能夠直接在體內表達抗原誘導免疫反應的疫苗。G蛋白是誘導機體產生RABV中和抗體的唯一抗原,將G蛋白基因與特定的活載體連接即為狂犬病活載體疫苗。有研究顯示,活載體疫苗能夠顯著提高抗原的免疫原性[10]。目前,用于狂犬病疫苗開發的活載體多為腺病毒。腺病毒載體具有宿主范圍廣、對人的致病性低和安全性高等多種優點,且能夠激活機體的體液免疫和細胞免疫[11]。人腺病毒(Human adenovirus,hAd)是早先用于活載體疫苗開發的載體,但人體大多都曾經感染過腺病毒,從而存在腺病毒抗體,導致重組的腺病毒活載體疫苗在人體的免疫效果較差。因此,hAd作為載體開發的狂犬病活載體疫苗多作為口服疫苗用于野生動物的免疫,在野生動物狂犬病預防和控制方面具有廣泛的應用前景[12]。

黑猩猩155型腺病毒(Chimpanzee adenovirus 155,ChAd-155)是從黑猩猩體內分離的一種野生型ChAd,與hAd有非常高的相似性,因此可以相同的受體進入宿主細胞。將RABV 糖蛋白(Glycoprotein,G)與ChAd-155相連后構建的狂犬病ChAd-155活載體疫苗(圖1),在經肌肉免疫小鼠時,單次注射即能夠產生很高的中和抗體滴度[高于0.5 IU/mL閾值的病毒中和抗體(Virus-neutralizing antibody,VNA)滴度],且具有明顯的劑量效應[13]。此外,Wang等將RABV G蛋白與ChAd-68構建的活載體疫苗免疫比格犬,能夠誘導機體產生特異性免疫反應,并且低劑量就可產生較高的中和抗體滴度[14]。Zhou等研究表明,RABV G蛋白與ChAd-68構建的活載體疫苗通過口服也能為小鼠提供免疫保護[15]。要實現WHO提出的消除狂犬病的目標,必需開發可對野生動物進行口服免疫的疫苗,提高野生動物的免疫覆蓋率。以ChAd為載體構建的疫苗在誘導免疫反應的同時,可規避預先存在的針對人類腺病毒血清型的抗載體抗體的潛在問題[13],具備制成野生動物口服疫苗的潛力,成為了狂犬病活載體疫苗研發的重點載體之一。此外,利用犬2型腺病毒(Canine adenovirus 2,CAV-2)作為載體開發的獸用狂犬病疫苗也已經進行了大量的研究,將狂犬病G蛋白與CAV-2連接制備的狂犬病疫苗,接種后不但可以產生較強的免疫效果,還具有良好的遺傳穩定性[16]。邱薇等的研究也表明,CAV-2活載體疫苗通過口服能使中華田園犬產生保護抗體[17]。

圖1 RABV糖蛋白與ChAd-155連接后構建的疫苗模式圖Fig.1 Schematic diagram of vaccine constructed by binding RABV glycoprotein to CHAD-155基因連接順序不代表實際應用中的連接順序;下圖同The gene linking order does not regresent the actual linking order in practical application. The same as below

痘病毒(Pox virus)也是狂犬病疫苗研究的病毒載體之一,痘病毒不但對外源基因的容納性較強,而且具有獨特的強啟動子,可增強外源基因轉錄和表達蛋白的效果。以山羊痘病毒(Goatpox virus,GPV)為病毒活載體,經同源重組獲得能夠表達狂犬病毒 G 蛋白的重組羊痘病毒,接種綿羊后所產生的G蛋白中和抗體雖然低于上海博湖生物科技有限公司的商品化滅活苗,但該結果揭示了痘病毒用于狂犬病活載體疫苗研究的可行性[18]。

目前,ChAd與G蛋白所構建的口服疫苗已應用于野生動物狂犬病的消除工作[15],而ChAd-155和痘病毒等狂犬病活載體疫苗仍處于研發或臨床試驗階段[13],其研究對未來研發動物用甚至人用狂犬病疫苗都具有潛在的指導意義。

2.2 核酸疫苗 核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗,其原理是將抗原基因與真核表達載體連接后導入機體,誘發機體對所表達的蛋白產生免疫反應,其優勢在于既可激活機體的體液免疫又可誘發細胞免疫,且機體只對所插入的抗原產生免疫反應,因此降低了副作用的產生。

DNA疫苗易于構建和儲存,因此目前狂犬病核酸疫苗開發以DNA疫苗為主[19]。研究顯示,狂犬病DNA核酸疫苗免疫比格犬4周時產生的中和抗體平均滴度達到3.23 IU/mL,54周時產生的中和抗體平均滴度仍可達到2.88 IU/mL,均顯著高于WHO所要求的0.15 IU/mL[20]。許永青通過刪除G蛋白的跨膜區和胞內區,添加非甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸寡脫氧核苷酸(CpG oligonucleotide CpG OND)佐劑,并結合電刺激的肌肉注射免疫動物,顯著提高了抗原表達量,DNA質粒的細胞轉化效率,從而增強了疫苗的傳遞效率、持續時間和免疫效果[21]。另外,通過殼聚糖納米顆粒包裹DNA能夠有效提高DNA疫苗的遞呈能力,并且具有緩釋作用(持續釋放24 d),從而提升疫苗的免疫效果[22]。然而,核酸疫苗的質粒會長期存在于體內,存在導致宿主基因突變的風險,同時質粒基因組的抗性基因會隨著DNA疫苗進入接種者體內,從而產生抗生素耐藥性等問題[23]。

與其他疫苗相比,RNA疫苗具有其獨特優勢,如mRNA是非整合性平臺,不存在感染或突變的風險,還可被細胞正常代謝降解,具有非常高的安全性;由于體外轉錄反應的高產性,mRNA疫苗還具有生產簡便、成本低等優勢[24]。然而,與其他狂犬病疫苗相比,狂犬病RNA疫苗的免疫保護力較低。表達狂犬病病毒G蛋白的RNA狂犬病病毒疫苗CV7201臨床Ⅰ期試驗結果顯示,實驗動物對該疫苗的耐受良好,但只有80%個體的抗體效價達到了免疫保護的要求,且大多數接種者均產生了不同程度的不良反應[25]。但最近的一項研究顯示,自擴增RNA疫苗在狂犬病的臨床試驗中有較好的免疫保護效果,與傳統mRNA疫苗(圖2)相比,自擴增RNA疫苗在較低劑量下顯示出較強的抗原表達[26]。因此,可通過深入研究自擴增狂犬病RNA疫苗,為今后RNA疫苗的研發提供理論支撐和數據支持。

圖2 傳統mRNA疫苗模式圖Fig.2 Schematic diagram of the traditional mRNA vaccine

2.3 病毒樣顆粒疫苗 病毒樣顆粒(Virus-like particles,VLPs)是由病毒的一種或幾種結構蛋白在體外以自主裝配方式形成的蛋白粒子,具有模擬天然病毒的形態和結構、不含遺傳物質、無感染和復制能力的優勢[27]。VLPs以正確構象和高度重復的形式展示抗原表位,能夠同時誘導體液免疫和細胞免疫,因此被應用到許多疫苗研究中。口蹄疫、豬流行性腹瀉、流感等病毒樣顆粒疫苗的成功研制,為狂犬病病毒樣顆粒疫苗(RABV-VLPs)的研究提供了可行性參考[28]。RABV G蛋白作為唯一刺激并誘導機體產生VNA的結構蛋白,是制備RABV-VLPs的最主要蛋白之一。孫宏宇將G蛋白和基質(Matrix,M)蛋白作為構建RABV-VLPs的基本組成蛋白,鞭毛蛋白(Flagellin)和大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞基(Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit,LTB)作為分子佐劑以膜錨定的形式嵌合在VLPs表面,形成與RABV相似的RABV-VLPs,通過肌肉注射免疫小鼠和犬,均誘導機體產生了顯著的RABV特異性體液免疫反應和細胞免疫反應,能夠有效產生抗體,并為免疫動物提供了有效的免疫保護(圖3)[29]。此外,添加某些刺激因子也可提高RABV-VLPs的免疫效果。例如,與單獨免疫RABV-VLPs相比,將粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)和RABV-VLPs疫苗同時注射小鼠,機體可產生更高的VNA滴度,證明GM-CSF對RABV-VLPs疫苗具有良好的輔助作用[30]。VLPs還能夠共表達多種融合蛋白,例如,將口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)的中和表位G-H環插入到RABV-G形成新的VLPs,免疫小鼠后可產生抗狂犬病特異性抗體和口蹄疫中和抗體,其中口蹄疫中和抗體滴度與商業口蹄疫疫苗相似[31]。因此,RABV- VLPs具有開發成為更安全有效的新型動物用狂犬病疫苗的潛能。

圖3 分子佐劑或融合蛋白嵌入VLPs疫苗模式圖Fig.3 Schematic diagram of molecular adjuvants or fusion proteins embedded in VLPs vaccine

2.4 亞單位疫苗 亞單位疫苗是指利用重組DNA技術,將致病微生物保護性抗原基因片段重組到原核或真核表達載體,并實現病毒蛋白的表達。亞單位疫苗不是完整的病原體,沒有感染能力[32]。狂犬病亞單位疫苗大多是基于RABV-G作為基礎的免疫原,使得在制備狂犬病亞單位疫苗時不需要篩選保護性抗原[33]。大多數亞單位疫苗在制備時都會將生產方式簡單、生產成本較低的大腸桿菌作為首選表達系統。然而,原核表達系統雖然能夠成功表達G蛋白,但免疫效果差,其免疫動物后產生的抗體水平遠低于商品苗[34]。使用桿狀病毒表達載體系統可以很好的提高蛋白表達量,而且其產生的RABV-G在后續動物試驗中也表現出較好的免疫效果[35]。以煙草葉片作為G蛋白表達系統,將G蛋白純化后免疫小鼠,可為小鼠提供較高的免疫保護效力[36]。此外,通過替換G蛋白上的信號肽能夠提高G蛋白的表達水平,研究顯示,將G蛋白原始信號肽替換為人體IgG的信號肽,G蛋白表達水平可從幾μg/L提高到50 mg/L[37]。

2.5 減毒疫苗 傳統狂犬病減毒疫苗的制備方法是將RABV減毒株經傳代后使其毒力降低,并且能夠誘發良好的免疫應答而不產生臨床癥狀。鄒劍等[38]將RABV在豚鼠頜下腺連續傳5代后獲得的弱毒株免疫小鼠,結果顯示,該弱毒株具有良好的免疫效果,并且具有良好的遺傳穩定性,為制備獸用狂犬病口服弱毒活疫苗打下了基礎。但減毒疫苗毒力的返祖現象仍然是目前減毒疫苗最值得關注的問題,而且具有一定活性和致病性的減毒疫苗對免疫功能低下者和孕婦都可能造成一定的影響。

為加快減毒疫苗的制備,提高其安全性,狂犬病減毒疫苗目前大多依靠反向遺傳技術,對基因組進行基因突變、缺失和修飾。目前,大多數狂犬病減毒疫苗都是通過將G蛋白的氨基酸進行突變或引入其他氨基酸進行改造,形成狂犬病減毒疫苗。研究顯示,在G蛋白中第333位氨基酸具有精氨酸(Arg)或賴氨酸(Lys)的菌株在接種后會使成年小鼠死亡,將該氨基酸進行突變后可使其致病性減弱,因此通過對G蛋白第333位氨基酸進行突變,是減毒疫苗制備的常用手段[39]。且突變形成的谷氨酸(Glu)殘基需要2個核苷酸替換才能恢復為致病性Arg,降低了致病性逆轉的可能性,但1個核苷酸取代足以將Glu殘基轉化為另一個致病殘基Lys,從而導致致病性逆轉,這表明突變減毒存在潛在的安全問題[40]。有研究表明,將狂犬病ERA株G蛋白第333位氨基酸(G333)處插入Arg或亮氨酸(Leu)所產生的ERA-G333Leu弱毒株免疫小鼠后,可產生較高的中和抗體,且毒力水平較低,表明通過在G333處引入其他氨基酸在開發具有高安全性的狂犬病減毒疫苗株中具有很高的效用[41]。

反向遺傳技術操作系統在狂犬病減毒疫苗的制備中發揮著關鍵作用,通過定向突變改造病毒基因組,獲得弱毒疫苗候選株,具備減毒途徑明確、效率高、毒力回復率低等優點,是狂犬病減毒疫苗研制的新方向[42]。目前,所有狂犬病新型疫苗研發過程中,安全性問題均是首要問題,尤其是RABV的分離培養、疫苗制備和臨床使用,需確保在防護恰當的情況下進行,甚至在生物安全實驗室進行操作,以防止致病毒株向外擴散。因此,反向遺傳技術所存在的毒力返強等安全性問題,是目前制約其發展的最大瓶頸。

3 展望

目前,新型狂犬病疫苗仍面臨諸多問題,如核酸疫苗免疫效果不盡理想,病毒樣顆粒疫苗的熱穩定較差且存儲困難,減毒疫苗在生產時對安全性要求極高,亞單位疫苗穩定性差且在細胞微環境中易降解等。針對此類問題已研究了一些解決方法,如在病毒樣顆粒疫苗外增加一層礦物質外殼,既能提高VLPs的免疫效果,又能增強其耐熱性[43];在核酸疫苗和亞單位的研發過程當中添加佐劑,以提高其免疫效果和穩定性[44];或通過提高生產過程中所需的安全水平來達到減毒疫苗生產過程中所需的高安全性。而針對人、寵物和野生動物3個群體開發安全性高、副作用低、免疫效果優的新型疫苗,是實現WHO 2030年消除人間狂犬病目標的關鍵手段,病毒樣顆粒疫苗和核酸疫苗所具備的安全性和高效性是未來人用狂犬病疫苗研究的重點。對各種寵物進行免疫覆蓋是降低人類狂犬病傳播的關鍵步驟,制備簡單、免疫效果優良的活載體疫苗和亞單位疫苗是未來開發廉價且高效的獸用疫苗的主要方向。但想從根本上控制狂犬病必須從源頭進行控制,對野生動物進行群體免疫才是最有效的方法,多種新型疫苗所制備的獸用口服狂犬病疫苗是從源頭控制狂犬病的最有力工具。因此,新型狂犬病疫苗的研究仍需進一步加深,加速開啟狂犬病疫苗研究的新篇章。