正交試驗優化苦豆子復方抗白色念珠菌物質的醇提工藝

王福玲,高 原,盛潔靜,王冬雪,王金宏,王 昊,韓曉宇,辛國松,3,楊 波,4

(1. 哈爾濱商業大學藥學院,黑龍江 哈爾濱 150076 ; 2.浙江上藥九旭藥業有限公司,浙江 金華 321016 ;3. 教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心,黑龍江 哈爾濱 150076 ; 4. 黑龍江省預防與治療老年性疾病藥物研究重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150076)

畜牧業集中養殖家禽時,若環境不衛生,容易引起真菌感染。在機體免疫能力下降或菌群失衡時,白色念珠菌感染可引發皮膚炎、陰道炎、甲溝炎、口瘡、肺炎和腸胃炎等常見炎癥。通過查閱文獻可知,苦豆子復方具有抑制白色念珠菌的作用[1]。為更好的發揮苦豆子復方治療和防御炎癥的效果,本試驗主要以醇提的方法提取苦豆子復方中抗白色念珠菌物質,以最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration,MIC)值為評價指標,在單因素考察基礎上,采用正交設計篩選最佳提取工藝,得出苦豆子復方中抗白色念珠菌物質的最佳提取工藝,從而為其在醫藥和日用化學等行業中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 細菌與藥材 苦豆子、蛇床子、黃柏,均購自哈爾濱市中藥材市場,經哈爾濱商業大學藥學院中藥教研室鑒定分別為豆科植物苦豆子SophoraalopecuroidesL.的種子、傘形科植物蛇床Cnidiummonnieri(L.)Cuss.的干燥成熟果實、蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinense Schneid.的干燥樹皮。白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC10231,購自黑龍江省微生物研究所。

1.2 主要試劑 95%乙醇(批號為20170608),購自天津市天力化學試劑有限公司;蛋白胨(批號為20190308)、酵母膏(批號為20180430),均購自北京奧博星生物技術有限責任公司;葡萄糖(批號為20180711),購自國藥集團化學試劑有限公司;生理鹽水(批號為170525D1),購自哈爾濱三聯藥業股份有限公司。

1.3 主要儀器 電子分析天平(型號為BSA6202S-CW),賽多利斯科學儀器有限公司;數顯恒溫水浴鍋(型號為HH-2),江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;循環水式多用真空泵(型號為SHB-3),鄭州長城科工貿有限公司;高效萬能粉碎機(型號為B-56-2),天津泰斯特儀器有限公司;超聲波清洗機(型號為HS-20D),上海新芝生物技術研究所;精密恒溫培養箱(型號為BP-9082)、電熱鼓風干燥箱(型號為DHG-9070A),上海一恒科學儀器有限公司;紫外超凈工作臺(型號為AC2-4S1 HDL),北京東聯哈儀器制造有限公司。

1.4 培養基的配制 取10.00 g蛋白胨和5.00 g酵母膏于具塞錐形瓶中,加蒸餾水定容至400 mL,攪拌均勻后進行高壓蒸汽滅菌(121 ℃,20 min);另取10.00 g葡萄糖,加蒸餾水定容至100 mL,攪拌均勻后進行高壓蒸汽滅菌(115 ℃,15 min),最后將2種溶液混合,即為酵母浸出粉胨葡萄糖培養基(Yeast peptone dextrose medium,又稱YPD液體培養基)。

1.5 菌懸液的配制 從生長白色念珠菌的固體培養基上挑選狀態較好的白色念珠菌單菌落,接種于YPD液體培養基中,30 ℃條件下恒溫培養24 h后,取出菌液,稀釋至105CFU/mL,備用。

1.6 單因素試驗 (1)溫度(A)對提取的影響:以MIC為指標,按1∶1∶1的比例稱取苦豆子、黃柏、蛇床子各1 g,以料液比1∶10用75%乙醇分別在60、70、80、90 ℃和100 ℃條件下提取1 h。(2)料液比(B)對提取的影響:以MIC為指標,按1∶1∶1的比例稱取苦豆子、黃柏、蛇床子各1 g,分別以料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25用75%乙醇在80 ℃條件下提取1 h。(3)時間(C)對提取的影響:以MIC為指標,按1∶1∶1的比例稱取苦豆子、黃柏、蛇床子各1 g,以料液比1∶10用75%乙醇在80 ℃條件下分別提取0.5、1.0、1.5、2.0 h和2.5 h。(4)次數(D)對提取的影響:以MIC為指標,按1∶1∶1的比例稱取苦豆子、黃柏、蛇床子各1 g,以料液比1∶10用75%乙醇在80 ℃條件下分別提取1、2、3、4次和5次。(5)乙醇體積分數(E)對提取的影響:以MIC為指標,按1∶1∶1的比例稱取苦豆子、黃柏、蛇床子各1 g,以料液比1∶10分別用55%、65%、75%、85%和95%乙醇在80 ℃條件下提取1 h。

1.7 正交試驗 綜合單因素試驗結果,選取5個單因素中具有代表性的3個水平來進行正交試驗,按L18(37)正交表安排試驗,以MIC值為指標。

1.8 最小抑菌濃度(MIC)的測定 干燥好的苦豆子復方提取物加生理鹽水配制成40 mg/mL的溶液,采用96孔板2倍稀釋法測定MIC值。取一96孔板,在第1、2列的B孔及以下的每個孔中加入生理鹽水100 μL,向A1～A2孔中加入已配制好(濃度40 mg/mL) 的苦豆子提取物溶液200 μL,混勻后從第1行A孔中吸取100 μL待測溶液加入第2行B孔中,以此類推,加至第7行G孔,從G孔中吸取100 μL溶液打入廢液缸。在第1列每個孔中加液體培養基100 μL,作為對照組,在第2列每個孔中加入菌液100 μL,作為試驗組。其他各列分別按上述操作加入各個藥液,將制備好的96孔板置于30 ℃恒溫培養箱中培養18 h,觀察菌液生長情況,菌液透明澄清時所對應的藥液濃度即為MIC。

1.9 驗證試驗 用正交試驗所得的最佳提取條件,重復3次,測定MIC值,驗證提取工藝。

1.10 數據統計與分析 使用SPSS 16.0軟件對試驗數據進行統計與分析。

2 結果

2.1 單因素試驗 結果如圖1所示,在溫度為60、70 ℃和80 ℃時MIC值較小,所以選取這3個提取溫度進行正交試驗;當料液比為1∶15、1∶20和1∶25時MIC值較小,所以選取這3個料液比進行正交試驗;當時間為1.5、2.0 h和2.5 h時MIC值較小,所以選取這3個提取時間進行正交試驗;當提取次數為1、2、3次時MIC值較小,所以選取這3個提取次數進行正交試驗;在乙醇體積分數為55%～65%時MIC值較小,抑菌效果好,所以選取乙醇體積分數55%、60%和65%這3個水平進行正交試驗。

圖1 各單因素對苦豆子復方醇提取MIC的影響Fig.1 Effects of single factors on the MIC of alcohol extraction of Kudouzi compound

各因素選取3個較低水平進行五因素三水平的正交試驗,見表1。

2.2 正交試驗 結果如表2所示,苦豆子復方醇提取的最佳工藝條件為A1B2C2D1E3,即提取溫度為60 ℃,料液比為1∶20,提取時間為2.0 h,提取次數為1次,乙醇體積分數為65%,抑菌效果好。方差分析表明,5個因素對苦豆子復方抗白色念珠菌影響的主次順序為A>B>D>C>E。

表2 L18(37)正交試驗分析結果Table 2 Result of L18(37) orthogonal design analysis

從表3可知,提取溫度(A)和料液比(B)顯著影響苦豆子復方醇提物抑菌效果(P<0.05),其他因素對醇提物的MIC值無顯著影響(P>0.05)。

表3 方差分析結果Table 3 Result of the variance analysis

2.3 驗證試驗 用正交試驗所得的最佳提取條件,重復3次,提取的苦豆子復方抗白色念珠菌物質的MIC值均為1.25 mg/mL,由此可知,本試驗所得苦豆子復方抗白色念珠菌物質的最佳提取工藝數據穩定可靠。

3 討論

白色念珠菌是較為常見的真菌感染致病菌,臨床上的抗真菌藥品多為西藥,大量應用會導致真菌耐藥性的增多,使得真菌感染的治療越發困難。中藥具有有效、副作用小、不易產生耐藥性等優點[2]。已有研究表明,復方苦豆子栓劑、復方苦參洗劑、蛇床子苦參散等中藥復方制劑在臨床上具有良好的抑菌療效[3-5]。本試驗以現有的中藥復方制劑為基礎,通過各中藥協同增效,優化制備工藝,得到治療白色念珠菌效果較好的苦豆子復方物質,使其更好的用于治療。

苦豆子和黃柏大苦大寒,具有清熱燥濕、解毒療瘡、殺蟲止癢止痛之功[6-7];蛇床子寒中有溫、溫而制寒,具有以溫陽利濕之功[8]。中藥有效成分如生物堿具有很強的抗菌效應[9-10]。復方不但能增強各單味藥特有的功效還能改善其他病癥,符合協同給藥規律。

不同的提取方法對有效成分影響很大,本試驗對苦豆子復方抗白色念珠菌的提取工藝進行正交試驗優化,得出最佳提取工藝為20倍的65%乙醇,在溫度為60 ℃的條件下,提取2.0 h,提取1次,此時得到的提取物具有較好的抗白色念珠菌活性。本試驗為深入研究苦豆子抗菌機理提供了數據支持。另外,苦豆子、蛇床子和黃柏來源廣泛、經濟價廉、安全性高、副作用小,具有很大的開發價值,但其有效成分和抗菌機理有待進一步研究。