致雛鵝痛風相關病原的分子檢測

王家英,金美玲,儲麗麗,王笑言,張大丙

(中國農業大學動物醫學院 農業部動物流行病學重點實驗室,北京 海淀 100193)

鵝星狀病毒(Goose astrovirus,GoAstV)基因2型(GoAstV-2)是2014年從雛鵝腸炎病例中發現的一種新病毒,屬星狀病毒科、禽星狀病毒屬的未定種[1]。在雛鵝痛風病例中,GoAstV-2的感染率很高[2],目前多認為GoAstV-2是雛鵝痛風的主要致病病原[3-8]。鵝細小病毒(Goose parvovirus,GPV)是細小病毒科、細小病毒亞科、依賴細小病毒屬成員,感染雛鵝可導致小鵝瘟發生[9]。在雛鵝痛風病例中,亦曾檢出GPV,但GPV陽性率高低不等[8,10-12]。

2021年3月,在江西省某養鵝場,已使用雛鵝痛風和小鵝瘟抗體制品進行過預防性接種的雛鵝在5日齡時發生痛風病。本試驗旨在通過星狀病毒通用RT-PCR和水禽細小病毒通用PCR對7日齡死亡病例的組織樣品進行檢測,并對擴增產物進行測序和序列分析,評估雛鵝痛風病例中GoAstV-2和GPV混合感染情況,以期為雛鵝痛風的防控提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 TRIzol,購自Thermo Fisher Scientific公司;血液/組織/細胞基因組DNA提取試劑盒,購自天根生化科技(北京)有限公司;M-MLV反轉錄酶、M-MLV 5×Buffer、dNTP(10 mmol/L),均購自普洛麥格生物技術有限公司;RNase Inhibitor,購自TaKaRa公司(大連);2×Phanta Max Buffer、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、dNTP Mix(10 mmol/L),均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒,購自康寧生命科學(吳江)有限公司;pEASY-Blunt Zero載體、Trans-T1感受態細胞,均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 主要儀器 珠磨式組織勻漿機,Biospec公司產品;紫外凝膠成像儀,英國GENIUS公司產品。

1.3 病例來源 2021年3月,從江西省某養鵝場收集9只7日齡病死興國灰鵝。

1.4 試驗方法

1.4.1 大體病變觀察和病料處理 剖檢9只7日齡病死興國灰鵝,觀察大體病變,分別采集肝臟樣本,共9份,按1∶5(W/V)比例加入滅菌生理鹽水,用珠磨式組織勻漿機制成勻漿,在4 ℃條件下,12 000 g離心15 min,收獲上清液。

1.4.2 核酸提取 用TRIzol從250 μL上清液提取病毒RNA;用血液/組織/細胞基因組DNA提取試劑盒從200 μL上清液提取DNA。

1.4.3 GoAstV的RT-PCR檢測 用參考文獻[13]報道的引物ORF1bR(表1)進行反轉錄。將5 μL RNA模板與2 μL引物ORF1bR混合,置70 ℃作用5 min,冰浴5 min,再加入M-MLV反轉錄酶1 μL、M-MLV 5×Buffer 5 μL、dNTP(10 mmol/L)5 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL和DEPC水6.5 μL,混勻后置42 ℃作用1 h、94 ℃作用5 min。

表1 檢測臨床樣品所用引物Table 1 Primes used for clinical sample detection

PCR擴增體系(50 μL):cDNA 5 μL、引物ORF1bF和ORF1bR(表1)各2 μL、2×Phanta Max Buffer 25 μL、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL、dNTP Mix(10 mmol/L)1 μL和ddH2O 14 μL。按照參考文獻[13]報道的程序通過PCR擴增GoAstV的ORF1b基因。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳,用紫外凝膠成像儀觀察并拍照記錄。

1.4.4 GPV的PCR檢測 用參考文獻[14]報道的引物VP3F和VP3R(表1)通過PCR擴增GPV的VP3基因。取DNA 5 μL,按1.4.3建立50 μL PCR反應體系。PCR擴增程序:94 ℃預變性10 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,共35個循環;72 ℃延伸10 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳,用紫外凝膠成像儀觀察并拍照記錄。

1.4.5 克隆和測序 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物,用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進行純化。將PCR產物克隆至pEASY-Blunt Zero載體,構建重組質粒。用重組質粒轉化Trans-T1感受態細胞,經細菌培養和陽性克隆子篩選,委托北京擎科生物科技有限公司測序。

1.4.6 序列同源性分析和遺傳演化分析 用SnapGene 5.0(Insightful Science)進行序列編輯,在GenBank中用BLASTx(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行序列相似性檢索。從GenBank下載GoAstVORF1b序列和GPVVP3序列作為參考序列,用Clustal W程序(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)分析序列同源性,用MEGA 6軟件中的鄰接法(Neighbor-joining method)[15]進行遺傳演化分析。

2 結果

2.1 大體病變觀察 剖檢病死雛鵝,可見典型的內臟痛風和關節痛風。在心臟、肝臟(圖1A)、腺胃、肌胃、脾臟(圖1B)、胰腺、腸道、腸系膜(圖1C)和腹膜的表面均可見白色尿酸鹽沉積。腎臟腫脹,有尿酸鹽沉積,輸尿管擴張,內含白色物質(圖1D)。膽囊腫脹,充盈膽汁,部分病例的膽囊內含白色尿酸鹽結晶。有些病例的食道和肌肉表面也見有尿酸鹽沉積。膝關節、跗關節、跖趾關節和趾節間關節腫脹,剖檢可見后肢各個關節有不同程度的尿酸鹽沉積。剖開頸部、背部和翅部皮膚,可見頸部、軀干和前肢各關節均有不同程度的尿酸鹽沉積。

圖1 病死雛鵝的大體病變(標尺=10 mm)Fig.1 Gross lesions in dead goslings(Bar=10 mm)A:心臟和肝臟; B:腺胃、肌胃和脾臟; C:胰腺、腸道和腸系膜; D:腎臟和輸尿管A:Heart and liver; B:Muscle stomach,glandular stomach and spleen; C:Pancreas,intestinal tract and mesentery; D:Kidney and ureter

2.2 GoAstV和GPV的檢測 用星狀病毒的通用RT-PCR和水禽細小病毒的通用PCR進行檢測,9份肝臟樣品均為陽性(圖2)。測序和序列分析結果顯示,438 bp擴增產物為GoAstV的ORF1b序列,539 bp擴增產物為GPV的VP3序列。用縮寫JX表示樣品的地區來源,用阿拉伯數字1～9代表9只病死興國灰鵝,用英文字母a和b分別表示從同一份肝臟樣品檢出的GoAstV和GPV,將GoAstV的毒株號稱為JX1a株、JX2a株和JX3a株等,將GPV的毒株號稱為JX1b株、JX2b株和JX3b株等。

圖2 臨床樣品中GoAstV-2 ORF1b基因(A)和GPV VP3基因(B)的擴增Fig.2 Amplification of GoAstV-2 ORF1b gene (A) and GPV VP3 gene (B) in clinical samplesM:DL-2 000 DNA相對分子質量標準; 1～9:肝臟; 10:陽性對照; 11:陰性對照M:DL-2 000 DNA Marker; 1-9:Livers; 10:Positive control; 11:Negative control

2.3 序列同源性分析和遺傳演化分析 對所有擴增產物進行序列測定,Clustal W分析結果顯示,在擴增的GoAstV 438 ntORF1b區,本試驗所測JX1a株、JX2a株和JX3a株等9株GoAstV的核苷酸序列同源性為99%～100%,與HN1G株、HN2G株和GD株等11株GoAstV-2參考毒株[1,4-7,16,17]的核苷酸序列同源性為95%～98%,與B2株、B10株和B14株等4株GoAstV-1參考毒株[18]和GoAstV-3參考毒株FLX株[19]的核苷酸序列同源性為63%～67%。用438 ntORF1b序列進行遺傳演化分析的結果顯示,本試驗所測9株GoAstV與已知GoAstV-2聚為同一個分支,而已知GoAstV-1和GoAstV-3形成2個獨立的分支(圖3)。

圖3 GoAstV ORF1b基因的遺傳演化分析Fig.3 Phylogenetic analysis based on ORF1b genes of GoAstV毒株表示方式:毒株號/宿主/國家/檢測或分離時間; Go:鵝; Ch:雞; CH:中國; SL:斯里蘭卡; ▲:本試驗所測毒株; 以火雞星狀病毒1型(Turkey astrovirus 1,TAstV-1)n130株作為Outgroup; 括號中為序列登錄號Virus strains are denoted as following:Strain number/Host/Country/Year of detection or isolation; Go:Goose; Ch:Chicken; CH:China; SL:Sri Lanka. ▲:Strains detected in this study. Turkey astrovirus 1 (TAstV-1) strain n130 is included as an outgroup.GenBank accession numbers of the sequences are indicated in parentheses

在擴增的GPV 539 ntVP3區,本試驗所測JX1b株、JX2b株和JX3b株等9株GPV的核苷酸序列同源性為99%～100%,與HN1P株、HN2P株和HN3P株等從肉鴨異常換羽病例檢出的GPV[20]的核苷酸序列同源性亦為99%～100%,與JS1株、HB株和QH15株等從鴨短喙與侏儒綜合征(Short beak and dwarfism syndrome,SBDS)病例分離的GPV[21-24]的核苷酸序列同源性為97%～99%,與B株、LB株和VG32-1株等GPV經典毒株[25-29]的核苷酸序列同源性為93%～98%。用539 ntVP3序列進行遺傳演化分析的結果顯示,GPV形成2個不同的分支(稱為1分支和2分支),2分支進一步分為2個亞分支(稱為2.1分支和2.2分支),B株、LB株和VG32-1株等GPV經典毒株聚為1分支,從鴨SBDS病例分離的JS1株、HB株和QH15株等GPV分離株聚為2.1分支,本試驗從雛鵝痛風病例檢出的JX1b株、JX2b株和JX3b株等9株GPV以及HN1P株、HN2P株和HN3P株等肉鴨異常換羽相關毒株聚為2.2分支(圖4)。

圖4 GPV VP3基因遺傳演化分析Fig.4 Phylogenetic analysis based on VP3 genes of GPV毒株表示方式:毒株號/宿主/國家/檢測或分離時間(如果信息能獲得); Go:鵝; Pd:北京鴨; Cv:櫻桃谷鴨; Md:番鴨; Sw:天鵝; CH:中國; UK:英國; GE:德國; HU:匈牙利; ▲:本試驗所測毒株;藍色:從肉鴨異常換羽病例檢出的GPV; 以番鴨細小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)FM株作為Outgroup; 括號中為序列登錄號Virus strains are denoted as following:Strain number/Host/Country/Year of detection or isolation (if available); Go:Goose; Pd:Pekin ducks;Cv:Cherry Valley ducks; Md:Muscovy ducks; Sw:Swan; CH:China;UK:England;GE:Germany;HU:Hungary. ▲:Strains detected in this study; Blue:GPV strains detected form duck abnormal molting cases. Muscovy duck parvovirus (MDPV) strain FM is included as an outgroup. GenBank accession numbers of the sequences are indicated in parentheses

3 討論

在本試驗中,雛鵝死亡病例均有典型的內臟和關節尿酸鹽沉積,表明用痛風抗體進行被動免疫未能提供有效保護;從所有病例的肝臟樣品中均檢出GoAstV-2和GPV,表明該雛鵝群存在GoAstV-2和GPV混合感染,與以往報道[8,10-12]相符。盡管有研究表明,使用GoAstV-2分離株接種雛鵝可復制出雛鵝痛風,但死亡率明顯低于自然感染所引起的死亡率,尿酸鹽沉積病變也較自然感染輕微[3-5]。據Woode 等報道,星狀病毒與其他腸道病毒混合感染時可使疾病更為嚴重[30]。因此,有必要評估GPV或其他病毒與GoAstV-2的混合感染在雛鵝痛風病發生中的作用。在本試驗中所觀察的雛鵝死亡病例并無小鵝瘟的特征病變,這一結果表明,用小鵝瘟抗體進行被動免疫可控制小鵝瘟的發生。然而,從所有病例均可檢出GPV,表明小鵝瘟抗體產品未能完全抑制GPV的復制。

在雛鵝痛風流行之前,已在我國鵝群發現GoAstV。用438 ntORF1b序列進行遺傳演化分析,可將GoAstV分為3個基因型:2011年從江西省6～7周齡健康朗德鵝檢出的毒株[16]屬于基因1型(GoAstV-1);2014年從湖南省雛鵝腸炎病例檢出的毒株[1,19]分別屬于基因2型(GoAstV-2)和基因3型(GoAstV-3)。從雛鵝痛風病例中檢出的毒株多屬于GoAstV-2[2-8]。也有研究者從雛鵝痛風病例分離到與GoAstV-3 FLX株相近的毒株,并用此類分離株復制出雛鵝痛風[31]。本試驗檢出的9株GoAstV均屬于GoAstV-2,進一步說明GoAstV-2是雛鵝痛風的主要致病病原。

用VP1和VP3基因序列進行遺傳演化分析,可將GPV區分為亞洲毒株(Asian strains)、疫苗或低致病性毒株(Vaccine &low pathogenic strains)、匈牙利強毒株(Hungarian virulent strains)和西歐毒株(West-European strains)[26],亦可進一步細分為疫苗或GPV低致病性毒株(Vaccine &low pathogenic GPV strains)、亞洲GPV毒株(Asian GPV strains)、歐洲1群毒株(European group 1 strains)、歐洲2群毒株(European group 2 strains)和歐洲3群毒株(European group 3 strains)[9]。事實上,在文獻[9,20,26,32]報道的VP1和VP3進化樹以及本試驗所構建的VP3進化樹中,不同來源的GPV均形成2個主要分支,在本試驗中提出的2分支對應于Tatár-Kis等[26]和Palya等[33]報道的西歐分支以及Swayne等[9]提出的歐洲3群,這類毒株是鴨SBDS的致病病原。1分支包含了Tatár-Kis等[26]和Swayne等[9]提出的其他所有分支,這類毒株是小鵝瘟的致病病原或弱毒疫苗株。1分支毒株對鴨無明顯致病性[32,34],2分支毒株對于鴨的毒力顯著增強[32],但對于鵝的致病性較經典毒株有所減弱[35]。從肉鴨異常換羽病例檢出的毒株與SBDS毒株高度相似,但在進化樹分別聚類,形成2個不同的小分支,反映出2分支毒株在鴨群流行后可能進一步發生了變異[20],故將SBDS的致病病原和肉鴨異常換羽相關毒株分別稱之為2.1分支和2.2分支。本試驗從雛鵝痛風病例檢出的毒株與肉鴨異常換羽相關毒株極為相似,歸屬于2.2分支,這類毒株對于雛鵝的致病性還有待于評估。