產細菌素糞腸球菌EF-3的分離鑒定及其細菌素理化特性

車笑吟,涂會鑫,楊舒涵,李琪瑤,董文龍

(吉林農業科技學院動物科技學院,吉林 吉林 132109)

奶牛乳房炎是奶牛飼養過程中一種危害極大的疾病,一旦發生會對奶牛胎次和產奶量產生影響,降低鮮奶的適口性和營養成分[1],而且增加治療成本和額外勞動力[2]。研究表明,奶牛乳房炎可由大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)和化膿隱秘桿菌(Trueperellapyogenes,T.pyogenes)等多種病原體引起,其中S.aureus引起的奶牛乳房炎約占50%[3]。S.aureus具有多種毒力因子,其產生的腸毒素sea、seb、sec、sed和see等會溶于牛奶中,如不慎飲用易使人患扁桃體炎和咽喉炎等疾病[4]。目前,使用細菌素是治療奶牛乳房炎較為理想的方法,可避免抗生素治療后在牛奶中的殘留,不破壞人體內正常的益生菌,不會引起部分人對抗生素的過敏反應,不會使人體對抗生素產生耐藥性,且不易引發重復感染。

S.aureus極易產生耐藥性[5],治療該菌引起的奶牛乳房炎主要有以下難點:S.aureus可能帶有多重耐藥基因,對多種抗生素具有耐藥性,限制了治療藥物的選擇;S.aureus還能侵入宿主細胞內,從而避免了部分抗生素的抗菌作用;S.aureus含有大量可移動遺傳元件,可實現耐藥基因在不同菌株間的轉移[6]。新疆牛源S.aureus臨床抗菌素敏感性調查結果顯示,牛源S.aureus呈現出多重耐藥的特征,大部分菌株同時對5種以上常用類型抗生素耐藥[7]。奶牛乳房炎的臨床治療,主要有中醫療法和西醫療法,中醫療法易受藥物質量、有效成分等因素影響,易出現治療效果不佳的情況,且治療成本偏高;西醫療法中長期使用抗生素易導致耐藥菌株增多,治療后病癥易反復[8]。據報道,牛奶中80%的殘留藥物來源于治療奶牛乳房炎的藥品[9]。細菌素是一種水解蛋白類物質,能有效地滲透生物膜且對人體無害。與抗生素相比,細菌素的抗菌譜較窄,具有一定的專一性和靶向性,且不易產生耐藥性[10]。本試驗從平菇中分離出1株產細菌素糞腸球菌,該細菌素僅對S.aureus具有抗菌作用,該細菌素有望作為動物生產生活中S.aureus感染的替抗產品。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料 新鮮平菇,購自吉林省吉林市某市場。

1.1.2 菌種 標準株:S.aureusATCC25923、E.coliATCC25922、T.pyogenesATCC19411;奶牛乳房炎臨床分離株:S.aureus:S1、S2,E.coli:E1、E2,T.pyogenes:T1、T2,均由吉林農業科技學院動物科技學院動物微生物與免疫研究室保存。

1.1.3 主要試劑 MRS肉湯培養基、MRS瓊脂培養基和MH瓊脂培養基,均購自青島海博生物技術有限公司;革蘭染色試劑,購自北京索萊寶科技有限公司;DNA提取試劑盒,購自南京諾唯贊生物科技有限公司;過氧化氫酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K,均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.4 主要儀器 超凈工作臺和PCR儀,均購自賽默飛世爾科技公司;恒溫氣浴振蕩器,購自上海博迅醫療生物儀器股份有限公司;高速離心機,購自鹽城市凱特實驗儀器有限公司;凝膠成像儀,購自伯樂生命醫學產品公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌的分離和純化 無菌條件下將平菇接種于乳酸細菌MRS肉湯培養基中,置于37 ℃搖床培養至菌液渾濁,涂布于MRS瓊脂培養基上,37 ℃恒溫過夜培養后進行純化,直至出現單菌落。

1.2.2 產抗菌物質菌株的篩選 將純化后的單菌落接種于MRS肉湯培養基,37 ℃搖床培養至對數生長期,室溫6 000 r/min離心10 min,取上清液,使用0.22 μm濾膜抽濾除菌,抽濾后的上清液放入旋轉蒸發儀,于50 ℃進行濃縮,將其體積濃縮為原體積的1/10,再次抽濾得到無菌濃縮上清液。在MH瓊脂培養基上以S.aureusATCC25923為指示菌采用瓊脂擴散法進行抑菌試驗,每孔加入200 μL經針式過濾器過濾后的濃縮上清液,室溫靜置1 h,37 ℃恒溫培養16 h,測量抑菌圈直徑,以此篩選產抗菌物質的菌株。為減小試驗誤差,所有抑菌試驗均進行3次重復,所得抑菌圈大小取平均值。

1.2.3 抗菌物質的初步確證 為排除過氧化氫的影響,在2 mL濃縮上清液中添加0.02 g過氧化氫酶,37 ℃水浴4 h后煮沸10 min,以未加入過氧化氫酶的原始濃縮上清液作為對照組;為了排除酸性物質的影響,將濃縮上清液用氫氧化鈉和乳酸調節至pH=7,以未調節pH的原始濃縮上清液作為對照組,按1.2.2進行抑菌試驗。

1.2.4 菌落和菌體形態的觀察 將產抗菌物質的細菌接種于MRS瓊脂培養基上,37 ℃恒溫培養16 h,觀察菌落形態,挑取單個菌落在酒精燈火焰上加熱固定,按照革蘭染色試劑盒說明書操作進行染色,于光學顯微鏡下觀察菌體形態。

1.2.5 菌株的16S rRNA PCR鑒定 將純化后的單菌落接種于MRS肉湯培養基中,37 ℃搖床培養至對數生長期,取1 mL菌液,12 000 r/min離心1 min,棄去上清液,收集菌體沉淀,按照DNA提取試劑盒說明書操作提取細菌基因組DNA。

以提取的基因組DNA為模板進行16S rRNA PCR擴增,使用細菌16S rRNA通用引物[11]:上游引物:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;下游引物:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應體系共25 μL:上、下游引物各1 μL,模板DNA 5 μL,PCR Mix 12.5 μL,ddH2O 5.5 μL。PCR反應條件:95 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,54 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,共30個循環;最后 72 ℃延伸7 min。取3 μL PCR擴增產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,檢測合格樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。將16S rRNA測序結果與NCBI數據庫中序列進行BLAST比對分析。

1.2.6 菌株分泌細菌素的蛋白酶敏感性測定 在菌株分泌細菌素中以0.2 g/mL為終濃度加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K。其中加入木瓜蛋白酶的細菌素置于55 ℃水浴,加入其余蛋白酶的細菌素置于37 ℃水浴,所有樣品水浴4 h后取出,沸水浴處理10 min使酶失活,按1.2.2進行抑菌試驗。

1.2.7 菌株分泌細菌素的穩定性 取5等份菌株分泌細菌素,將其pH分別調至3.0、4.0、5.0、6.0和7.0,靜置2 h,再將pH調回至4.6,按1.2.2進行抑菌試驗。取4等份菌株分泌細菌素,將其分別放入60、70、80、90和100 ℃水浴中加熱處理1 h,冷卻后按1.2.2進行抑菌試驗。

1.2.8 菌株分泌細菌素的抑菌譜檢測 選用導致奶牛乳房炎的E.coli、S.aureus、T.pyogenes為檢測對象,以10倍濃縮的MRS瓊脂培養基為對照組,再分別以S.aureusATCC25923、S1、S2、E.coliATCC25922、E1、E2、T.pyogenesATCC19411、T1、T2為指示菌,按1.2.2進行抑菌試驗。

2 結果

2.1 產抗菌物質菌株的篩選 經過初步篩選發現僅1株菌株的發酵上清液對S.aureusATCC25923具有抗菌作用,抑菌圈直徑平均值大小約為(20±1) mm。

2.2 抗菌物質的初步確證 結果顯示,過氧化氫酶處理過的濃縮上清液抑菌圈直徑大小不變,說明抗菌物質中不含過氧化氫;該細菌濃縮上清液的原始pH=4.6,將其調節至pH=7.0后仍有抑菌圈出現,說明起到抗菌活性的物質并非完全是酸性物質。

正因其抗菌作用并非由過氧化氫和酸性物質產生,故初步推斷該抗菌物質為細菌素。

2.3 菌落和菌體形態的觀察 MRS瓊脂培養基上出現白色、邊緣整齊的光滑、圓形菌落(圖1A);顯微鏡下革蘭染色呈陽性,成雙或短鏈排列的卵圓形球菌,無芽孢、無莢膜(圖1B)。

圖1 菌落(A)和菌體(B,1 000×)形態觀察Fig.1 Morphological observations of colony (A) and bacteria (B,1 000×)

2.4 菌株的16S rRNA PCR鑒定 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示,在1 500 bp左右出現明顯條帶,16S rRNA基因 PCR擴增片段大小與預期目的基因片段大小一致。分離菌株16S rRNA測序結果與NCBI數據庫中糞腸球菌的同源性高達99.35%,遂將該菌株命名為EF-3。

2.5 EF-3分泌細菌素的蛋白酶敏感性測定 結果顯示,胰蛋白酶和蛋白酶K處理后的細菌素抗菌活性明顯下降,而經胃蛋白酶和木瓜蛋白酶處理的細菌素抗菌活性均無明顯變化(表1)。

表1 蛋白酶對EF-3分泌細菌素活性的影響Table 1 Effect of proteases on the activity of EF-3 secreted bacteriocins

2.6 EF-3分泌細菌素的穩定性 結果顯示,EF-3分泌細菌素抗菌活性幾乎不受溫度的影響,在100 ℃水浴4 h條件下依舊具有良好抗菌活性;但抗菌活性受環境pH變化影響較大,該細菌素在pH=4.0～6.0時能保持較強抗菌活性,在pH=3.0時失去抗菌活性(表2)。

表2 溫度和pH對EF-3分泌細菌素抗菌能力的影響Table 2 Effect of temperature and pH on the antibacterial ability of EF-3 secreted bacteriocins

表3 細菌素的抑菌譜Table 3 Antibacterial spectrum of the bacteriocins

2.7 EF-3分泌細菌素的抑菌譜檢測 結果顯示,該細菌素僅對S.aureusATCC25923、S1、S2有抗菌作用;對E.coli、T.pyogenes的標準株和臨床分離株均無抗菌活性。

3 討論

S.aureus是引發奶牛乳房炎的重要病原菌,主要通過奶牛的乳頭導管或乳房皮膚外傷進入乳房引發炎癥,病牛主要癥狀是泌乳減少,如果沒有得到合理治療會對發情和泌乳產生影響,形成瞎乳頭,給奶牛產業健康發展帶來巨大挑戰。目前,臨床主要依賴抗生素對奶牛乳房炎進行防治,但長期濫用抗生素會使致病菌產生嚴重的耐藥性并且危害動物體內正常的有益菌群,嚴重時可導致動物死亡[12],同時奶制品中殘留的抗生素嚴重危害人體健康。

糞腸球菌作為人和動物腸道內主要的菌群之一,可以抑制大腸桿菌和沙門菌等病原菌的生長,能夠改善腸道微循環,其代謝可產生有機酸、蛋白質等大分子生物活性物質。研究表明,其部分代謝產物具有良好的抗菌作用[13-16]。而細菌素對動物體很安全,且具有不易產生耐藥性、作用快、耐高溫、無殘留、無毒等優點[17],可用于代替抗生素控制致病菌的滋生和傳播,對保障動物健康具有重要意義。寶冠媛等研究表明,糞腸球菌細菌素抑菌譜較廣[18],無法對特定的細菌進行針對性消滅。而本試驗中糞腸球菌EF-3所分泌的細菌素僅針對S.aureus具有良好的抗菌活性,且具有良好的穩定性,有望作為防控奶牛乳房炎源S.aureus感染的替抗產品,具有重大研究價值和應用前景。