不同地區褐黃血蜱的單倍型多態性、遺傳分化和種系發育關系分析

李中波,侯強紅,舒 鳴,程天印

(1. 懷化職業技術學院,湖南 懷化 418000 ; 2.湖南農業大學動物醫學院,湖南 長沙 410128)

蜱(Ticks)為一類專性吸血體外寄生蟲[1,2],通過叮咬人類和動物,向被感染者傳播細菌、真菌、病毒和原蟲等病原微生物[2,3]。對人類而言,蜱是排在蚊之后的第二大疾病傳播媒介,但對于動物,蜱是第一大疾病傳播媒介[4],嚴重威脅人類和動物健康,具有重要的醫學和公共衛生學意義[5]。目前,蜱共被分為4科21屬,共計960種,但在我國僅發現2科9屬124種[6]。在所屬4科中,又以硬蜱科所包含的種類最多。褐黃血蜱(Haemaphysalisflava)作為硬蜱科、血蜱屬[5-7]眾多蜱蟲中的重要一員,廣泛分布于巴基斯坦、印度、斯里蘭卡、越南、日本、韓國、中國和俄羅斯遠東地區[2,5,8]。在我國,褐黃血蜱主要分布于湖南、廣西、河南、內蒙古、北京、山東、云南、吉林、上海、山西和東南沿海等地[9]。褐黃血蜱可寄生于豬、犬、黃牛、馬、豬獾、刺猬和熊貓等多種哺乳類動物體表[5,10-12]。此外,近年來,隨著分子生物學和測序技術的快速發展,不斷有新的致病微生物從褐黃血蜱體內被檢出,例如克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo haemorrhagic fever virus)[13,14]、卡布托山病毒(Kabuto mountain virus)[15]、塔魯米蘇蜱傳病毒(Tarumizu tick virus)[15]、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[11,16]等。這些病原微生物不僅能引發人類和動物發病,造成巨大的經濟損失,甚至還可導致被感染者出現生命危險,對人類和動物的健康形成較大隱患。

單倍型(Haplotype,h)為單倍體基因型的簡稱,其多態性是指某一染色單體上具統計學關聯的一類單核苷酸多態性[17,18]。某一生物的單倍型多態性與個體多樣性的形成主要是因為其DNA序列上的堿基發生了變異,致使其遺傳信息產生了變化,從而造就生物個體和種群之間在外觀形態和遺傳結構等方面表現出一定程度的差異。因此,研究一個物種的單倍型多態性、遺傳分化和種系發育關系,不僅為物種的遺傳資源保護提供重要的信息和理論基礎,而且還有助于理解該物種在自然環境中的進化過程[18]。目前,國內外已有學者利用部分線粒體基因和核糖體基因研究了寄生蟲的遺傳多樣性、種群結構、單倍型多態性和種系發育關系。例如,Amzati等利用細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(Cytochrome C oxidase subunit 1,cox1)和12S rDNA基因序列對具尾扇頭蜱(Rhipicephalusappendiculatus)的種群結構和單倍型進行了研究[19];Malatji等利用cox1基因序列分析了不同地域雞蛔蟲(Ascaridiagalli)的種群結構和單倍型[20];馮雪皎利用cox1、16S rDNA和核酸內轉錄間隔2(Internal transcribed spacer region 2,ITS-2)基因序列分析了不同種群長角血蜱(Haemaphysalislongicornis)的單倍型和遺傳多樣[21]。然而,國內較多研究仍熱衷于蜱蟲種類的鑒定、歸類、形態學描述和所攜帶病原微生物的檢測,鮮有對同一種蜱蟲的單倍型多態性、遺傳分化等內容進行研究。

我國幅員遼闊,不同區域之間在地理、環境和氣候等方面存在著一定程度的差異,同一生物由于長時間受到帶有差異外部因素的影響,從而致使同一物種不同種群的蟲種出現個體多樣、種群差異和單倍型多態性,甚至出現遺傳分化。因此,本試驗以來自湖南、河南兩省不同地區的褐黃血蜱為研究對象,利用cox1、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞基Ⅳ(NADH dehydrogenase subunit Ⅳ,nad4)基因序列對其單倍型多態性、遺傳分化和種系發育情況進行分析,以期為后續蜱蟲種類的鑒定、分類和遺傳分化等方面研究提供有用的信息和技術參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 從湖南省常德市某豬獾養殖場采集若干只蜱蟲,隨機挑選出10只雌性飽血蜱蟲作為樣品,并分別編號為HN1、HN2、HN3、HN4、HN5、HN6、HN7、HN8、HN9和HN10;從河南省信陽市野外所捕獲的刺猬體表采集若干只蜱蟲(采集蜱蟲后,刺猬立即放生),隨機挑選出10只雌性飽血蜱蟲作為樣品,并分別編號為HE1、HE2、HE3、HE4、HE5、HE6、HE7、HE8、HE9和HE10。經形態學鑒定[22]所選蜱蟲均為褐黃血蜱,將其置于75%酒精溶液中保存、備用。

1.2 主要試劑 動物組織基因組DNA提取試劑盒,購自天根生化科技(北京)有限公司;2×EasyTaq酶,購自寶生物工程(大連)有限公司;蛋白酶K和2 000 DNA Marker,均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.3 主要儀器 PCR儀(ABI,型號2720),購自北京嘉鵬同創科技發展有限公司;凝膠成像分析儀(QUANTUM,型號CX5),購自北京昊諾斯科技有限公司;電子分析天平(型號AW220),購自日本島津株式會社島津企業管理(中國)有限公司;高速冷凍離心機(型號5418R),購自廣州雷得生物技術有限公司。

1.4 DNA提取 按照動物組織基因組DNA 提取試劑盒說明書操作,提取褐黃血蜱的基因組 DNA,置于-20 ℃保存、備用。

1.5cox1和nad4基因的PCR擴增 利用2×EasyTaq酶和2對特異性引物:cox1-F:5′-GGAACAATATATTTAATTTTTGG-3′,cox1-R:5′-ATCTATCCCTACTGTAAATATATG-3′和nad4-F:5′-CATAATACCCAGCCTTCTCC-3′,nad4-R:5′-ATGACTCCCAA-AAGGCTCA-3′,分別通過PCR擴增褐黃血蜱的cox1和nad4基因序列。PCR擴增反應體系(50 μL):2×EasyTaq酶25 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,DNA模板1 μL,ddH2O 22 μL。PCR反應條件:95 ℃(預熱)5 min;95 ℃(變性)30 s;53/54 ℃(cox1/nad4)(退火)30 s;72 ℃(延伸)1 min,共35個循環;72 ℃(延伸)5 min。吸取5 μL PCR產物于含有溴化乙錠(Ethidium bromide,EB)的1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。

1.6 目的基因序列的測序、比對、校準、對齊和提交cox1和nad4基因陽性PCR產物交由生工生物科技(上海)有限責任公司進行雙向測序(每個樣品3個生物學重復),將cox1和nad4基因序列于NCBI中進行BLAST比對分析,確認所獲序列均為目的基因序列,然后運用軟件Clustal X[23]分別校準和對齊,最后提交至GenBank,分別獲得基因登錄號。

1.7 基因變異位點、單倍型多態性(Haplotype diversity,Hd)和遺傳分化分析 運用軟件Clustal X對褐黃血蜱cox1、nad4和cox1+nad4基因序列進行基因變異位點分析;運用軟件DnaSP 5.0[24]、Network 4.6[25]和Arlequin 3.0[26]對cox1、nad4和cox1+nad4基因序列進行Hd和遺傳分化分析。

1.8 種系發育分析 基于所獲褐黃血蜱cox1和nad4基因序列,按照cox1+nad4方式組合,以褐黃血蜱〔Haemaphysalisflava(NC005292)〕、鐵角血蜱〔Haemaphysalisinermis(NC020335)〕、臺灣血蜱〔Haemaphysalisformosensis(NC020334)〕、長角血蜱〔Haemaphysalislongicornis(MG721210)〕、豪豬血蜱〔Haemaphysalishystricis(MH510034)〕和嗜群血蜱〔Haemaphysalisconcinna(NC034785)〕為內群,并以血紅扇頭蜱〔Rhipicephalussanguineus(AF081829)〕為外群(表1),運用軟件Clustal X、PhyML 3.0[27]和MEGA 5.0[28],采用最大似然(Maximum likelihood,ML)法和GTR+I+R模型[18],對褐黃血蜱的種系發育關系進行分析,并運用軟件FigTree v 1.3.1[29]構建種系發育樹。

表1 種系發育分析所選群蜱種基本信息Table 1 Basic information of selected tick species for phylogenetic analysis

2 結果

2.1 褐黃血蜱cox1基因的PCR擴增 褐黃血蜱cox1基因的PCR擴增結果如圖1所示,PCR擴增產物均為陽性,各泳道均擴增出與預期大小一致的900 bp單一條帶,無明顯的雜帶。

圖1 湖南(1～5)、河南(6～10)兩省部分褐黃血蜱cox1基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of cox1 gene of partial Haemaphysalis flava from Hunan (1-5) and Henan (6-10) provincesM:DL 2 000 DNA Marker; 1:HN1; 2:HN3; 3:HN5; 4:HN7; 5:HN9; 6:HE1; 7:HE3; 8:HE5; 9:HE7; 10:HE9

2.2 褐黃血蜱nad4基因的PCR擴增 褐黃血蜱nad4基因的PCR擴增結果如圖2所示,PCR擴增產物均為陽性,每泳道均擴增出與預期大小一致的700 bp單一條帶,無明顯的雜帶。

圖2 湖南(1～5)、河南(6～10)兩省部分褐黃血蜱nad4基因的PCR擴增Fig.2 PCR amplification of nad4 gene of partial Haemaphysalis flava from Hunan (1-5) and Henan (6-10) provincesM:DL 2 000 DNA Marker; 1:HN1; 2:HN3; 3:HN5; 4:HN7; 5:HN9; 6:HE1; 7:HE3; 8:HE5; 9:HE7; 10:HE9

2.3 目的基因序列的測序、比對、校準、對齊和提交 經測序獲得褐黃血蜱cox1和nad4基因序列的原始長度,經校準、對齊后,獲得其序列最終長度,分別為849 bp和626 bp。將cox1和nad4基因序列分別于NCBI上進行BLAST比對分析,結果顯示,目的基因序列均正確,最后將所獲得的cox1、nad4基因序列提交至GenBank,登錄號分別為KY021810～KY021809、KY065329～ KY065328。

2.4 基因變異位點、單倍型多態性和遺傳分化分析 基于cox1、nad4和cox1+nad4基因序列,運用軟件Clustal X進行變異位點分析,結果如表2所示,褐黃血蜱cox1基因序列共包含4個變異位點(轉換4個);nad4基因序列共包含3個變異位點(轉換2個,顛換1個);cox1+nad4基因序列含7變異位點(轉換6個,顛換1個)。

表2 cox1、nad4和cox1+nad4基因變異位點Table 2 Mutation sites of cox1,nad4,and cox1+nad4 gene

基于所得基因變異位點,利用軟件DnaSP 5.0和 Network 4.6對褐黃血蜱cox1、nad4和cox1+nad4基因序列的Hd進行分析,結果顯示,湖南和河南兩省褐黃血蜱cox1基因序列(849 bp)共含有5個單倍型(Haplotypes,h)(h=5,A1～A5,Hd=0.653);其nad4基因序列(626 bp)共含有3個單倍型(h=3,B1～B3,Hd=0.363);其cox1+nad4基因序列(1 475 bp)共含有7個單倍型(h=7,C1～C7,Hd=0.768);在這些單倍型中,單倍型A1、A2、B1、C1和C2所含的序列來自于湖南、河南兩省,其余單倍型所含序列僅來自湖南省或河南省(圖3)。

圖3 褐黃血蜱cox1、nad4和 cox1+nad4基因序列單倍型Network圖Fig.3 Haplotype network maps of cox1,nad4 and cox1+nad4 gene sequence of Haemaphysalis flava

此外,基于cox1、nad4和cox1+nad4基因序列,運用軟件DnaSP 5.0對來自湖南、河南兩省的褐黃血蜱進行遺傳分化分析,結果顯示,在cox1基因序列中,兩省褐黃血蜱的基因分化系數(Gene differentiation coefficient,Gst)為0.061,遺傳分化系數(Fixation index,Fst)為-0.047,基因流(Gene flow,Nm)為-5.625;在nad4基因序列中,兩省褐黃血蜱的Gst為0.004,Fst為0.074,Nm為3.125;在cox1+nad4基因序列中,兩省褐黃血蜱的Gst為-0.010,Fst為-0.015,Nm為-16.560。

2.5 種系發育分析 褐黃血蜱的種系發育分析結果如圖4所示,此系統發育樹共分為4個大分支(Clade Ⅰ～Clade Ⅳ);來自于湖南、河南兩省的褐黃血蜱與褐黃血蜱(NC005292)共處于Clade Ⅲ分支;臺灣血蜱與嗜群血蜱共處于Clade Ⅱ分支;長角血蜱與豪豬血蜱共處于Clade Ⅳ分支,而鐵角血蜱則單獨位于Clade Ⅰ分支。

3 討論

蜱蟲作為一類廣泛分布于世界各地的體外寄生蟲[30],由于受到各地域的地理、環境和氣候等因素的影響,其種群分布、外觀形態、遺傳結構和基因表達等方面均存在一定程度的差異,從而在同一物種不同種群之間出現個體多樣性、種群多樣性和單倍型多態性,甚至遺傳分化。例如,全球分布的微小扇頭蜱共分為5個基因型[31]。褐黃血蜱是一種地理分布較廣,宿主繁多的蜱蟲,但關于褐黃血蜱單倍型多態性和遺傳分化等方面的研究甚少,至今尚未清楚該物種是否具有單倍型多態性,不同種群之間是否發生遺傳分化。因此,研究不同地區褐黃血蜱的單倍型多態性和種系發育關系,以及分析它們之間是否已發生遺傳分化,對今后蜱蟲種類鑒定、分類研究,以及蜱蟲種群結構和種系發育分析等方面具有十分重要的意義。

本試驗基于cox1基因序列,發現湖南和河南兩省褐黃血蜱的cox1基因序列共包含5個單倍型(h=5,A1～A5,Hd=0.653),其中單倍型A1、A2所包含的序列來自于湖南、河南兩省,單倍型A3、A4和A5所包含的序列均只來自于湖南省,說明單倍型A1、A2為湖南和河南兩省褐黃血蜱所共享的古老單倍型;基于nad4基因序列,發現湖南和河南兩省褐黃血蜱的nad4基因序列共包含3個單倍型(h=3,B1～B3,Hd=0.363)。其中單倍型B1所包含的序列來自于湖南、河南兩省,單倍型B2所包含的序列僅來自于河南省,而單倍型B3所包含的序列僅來自于湖南省,說明單倍型B1為湖南和河南兩省褐黃血蜱所共享的古老單倍型;基于cox1+nad4基因序列,發現湖南和河南兩省褐黃血蜱的cox1+nad4基因序列共包含7個單倍型(h=7,C1～C7,Hd=0.768),其中單倍型C1、C2所包含的序列均來自于湖南、河南兩省,但單倍型C5所包含的序列僅來自于河南省,而剩下的單倍型所包含的序列均只來自于湖南省,說明單倍型C1、C2為湖南和河南兩省褐黃血蜱所共享的古老單倍型。此外,所有A、B和C類的單倍型均分散開來,未有聚集成簇的現象,說明湖南和河南兩省的褐黃血蜱之間未出現遺傳分化。結果表明,湖南、河南兩省褐黃血蜱之間雖存在一定程度的單倍型多樣性,但尚未出現遺傳分化的現象。

本試驗結果顯示,cox1和cox1+nad4基因序列的Fst值均小于0.050,表明兩省的褐黃血蜱之間未出現遺傳分化的現象,與單倍型多態性分析結果相一致。然而,nad4基因序列的Fst值為0.074,介于0.050～0.150,說明湖南和河南兩省褐黃血蜱之間存在中等程度的遺傳分化,這可能暗示nad4基因序列不適合被應用于褐黃血蜱的遺傳分化研究。此外,基于cox1、nad4和cox1+nad4序列的Nm值,發現cox1和cox1+nad4的Nm值均為負值,表明兩省之間的褐黃血蜱存在較低程度的基因交流,與其Fst值均小于0.050相符合,但nad4的Nm值為3.125(>0),則表明兩省之間的褐黃血蜱之間存在較高頻率的基因交流,兩結果相互矛盾。筆者推斷這主要原因可能是nad4基因序列不能被應用于遺傳分化和基因流研究,但也有學者認為基因流是影響物種發生遺傳分化的因素之一,其主要作用是削弱種群間的遺傳差異,其強弱受多種因素影響,而易存在較大的差異,故而基因流的強弱不能反應物種是否發生遺傳分化[32]。例如,當自然選擇的作用超過基因流時,即使存在一定的基因流,但也會發生了較大的遺傳分化[33,34]。

本試驗基于cox1+nad4基因序列所構建的褐黃血蜱種系發育結果顯示,湖南和河南兩省的褐黃血蜱相互摻雜在一起,共同處于種系發育樹的Clade III分支,表明兩省褐黃血蜱親緣關系較近,與單倍型多態性和遺傳分化分析的結果相吻合,同樣表明兩地區的褐黃血蜱未出現遺傳分化現象。此外,結果顯示,褐黃血蜱與臺灣血蜱和嗜群血蜱的親緣關系最近,與長角血蜱和豪豬血蜱的親緣關系次之,而與鐵角血蜱的親緣關系最遠。

綜上,本試驗結果表明,來自于湖南、河南兩省的褐黃血蜱之間雖存在單倍型多態性,但它們之間共享著古老的單倍型,且不同單倍型之間也未有簇集成團的現象,說明兩省的褐黃血蜱之間所存在的親緣關系較近,尚未出現遺傳分化。