小鼠Usp2基因序列分析、真核表達載體構建和啟動子功能鑒定

張 宇,李 超,馬天天,馬白榮,李 丹,周 棟,靳亞平,陳華濤

(西北農林科技大學動物醫學院農業農村部動物生物技術重點實驗室,陜西 楊凌 712100)

泛素化作為蛋白質翻譯后修飾的一種重要調控機制,是指在泛素激活酶E1、泛素結合酶E2和泛素連接酶E3的共同作用下,蛋白質與泛素分子結合形成底物復合物的過程[1,2]。泛素化在調節蛋白質的穩定性、亞細胞定位和蛋白酶體介導的蛋白質降解過程中發揮重要作用[3,4]。作為一種動態的、可逆的蛋白翻譯后修飾過程,泛素化參與調控機體的大量生理功能,如細胞信號轉導、DNA損傷修復、細胞分裂分化、炎癥和免疫反應等[5-7]。去泛素化是泛素化的可逆過程,通過去泛素化酶(Deubiquitinating enzymes,DUBs)將泛素分子與底物蛋白分離,使底物蛋白免于被泛素化途徑降解,對蛋白的穩定和細胞內環境的穩態維持至關重要[8,9]。目前,已知的成員數量最多、結構最具多樣性的DUBs家族是泛素特異性蛋白酶(Ubiquitin-specific proteases,USPs)家族[10]。其中,USP2是USPs家族的重要成員,該基因主要編碼USP2-45和USP2-69兩種蛋白亞型[11,12],參與調控細胞的增殖凋亡和能量代謝等,同時在機體炎癥反應和腫瘤發生發展過程中發揮重要作用[13-18]。前期研究發現,Usp2基因豐富表達于哺乳動物的睪丸組織,參與調控精子發生[19]。隨著研究的深入,Usp2基因被發現廣泛表達于腦、心臟、肝臟、腎臟、骨骼肌和巨噬細胞等器官、組織和細胞中[12,20,21]。

晝夜節律生物鐘是一種以近似24 h為周期的內源性自主節律性振蕩系統,控制著機體的睡眠-覺醒和進食等生理功能和行為活動,在哺乳動物體溫變化、激素分泌和能量代謝過程中發揮重要作用[22]。在細胞層面,哺乳動物生物鐘是由生物鐘基因(Bmal1、Clock、Pers、Crys和Rev-erbs等)及其編碼蛋白(BMAL1、CLOCK、PERs、CRYs和REV-ERBs等)組成的正負反饋轉錄-翻譯環路相互作用而形成的[23]。正調控因子(腦肌類芳香烴受體核轉位蛋白1(Brain and muscle Arnt-like protein-1,BMAL1)與晝夜運動輸出周期蛋白(Circadian locomotor output cycles kaput, CLOCK)結合形成BMAL1-CLOCK異源二聚體激活負調控因子Pers、Crys以及其他鐘控基因的轉錄,當周期蛋白(Period,PERs)和隱花色素蛋白(Cryptochromes,CRYs)在細胞質中積累到一定數量后轉移到細胞核中,抑制BMAL1-CLOCK的轉錄活性;而細胞質中的酪蛋白激酶CKIδ和CKIε能夠引起PERs和CRYs復合物的降解,細胞質中的PERs和CRYs含量下降會再次促發周期起始,如此循環往復[24,25]。已有證據表明,BMAL1-CLOCK異源二聚體可與其下游靶基因啟動子特異序列E-box元件結合,激活下游靶基因的轉錄[26,27]。前期研究發現,小鼠12個組織器官中僅有10個基因共同存在節律性表達,而Usp2基因便是其中之一,節律性表達于哺乳動物絕大多數組織和器官中[13]。進一步研究發現,Usp2基因的主要轉錄本Usp2-45 mRNA節律性表達于小鼠肝臟組織,而Usp2-69 mRNA的表達卻無明顯的節律性變化;Usp2-45 mRNA在Bmal1肝臟特異性敲除小鼠的肝臟中幾乎完全喪失節律性變化,提示生物鐘系統可能選擇性調控Usp2-45的節律性表達[13]。然而,目前關于生物鐘系統選擇性調控Usp2-45節律性表達的分子機制尚不清楚,亟需進一步的深入研究。

本試驗對小鼠Usp2基因序列及其編碼蛋白的基本理化特性和結構功能進行了預測分析,成功克隆了Usp2-45的編碼序列(Coding sequence,CDS),構建了其真核表達載體。同時,本試驗成功克隆了小鼠Usp2-45和Usp2-69的啟動子區域,構建了不同長度Usp2啟動子的熒光素酶報告載體,發現了生物鐘系統對Usp2-45和Usp2-69啟動子的選擇性調控作用,并初步確定了生物鐘系統調控Usp2-45轉錄的重要功能區,為后續深入解析生物鐘系統與USP2互作的分子機制提供了前期基礎和關鍵材料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 TRIzol、Quick CutTMXhoⅠ、Quick CutTMKpnI、Quick CutTMBglⅡ、PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase和PrimeSTAR?HS DNA Polymerase,均購自日本TaKaRa公司;SYBR?qPCR Mix,購自日本TOYOBO公司;基因組提取試劑盒和無內毒素小提中量試劑盒,均購自北京天根生化科技有限公司;ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit,購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;胎牛血清,購自美國HyClone公司;胰蛋白酶、抗生素、DMEM高糖培養基和Opti-MEM培養基,均購自美國Gibco公司;TurboFect Transfection Reagent,購自美國Thermo Fisher科技有限公司;雙熒光素酶報告實驗試劑盒,購自美國Promega公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒,購自江蘇凱基生物技術股份有限公司;HRP共軛羊抗兔抗體,購自中國中杉金橋公司;HRP共軛鼠抗β-actin抗體,購自中國三箭公司;兔抗FLAG抗體,購自美國Abcam公司;ECL HRP底物試劑盒,購自北京迪寧生物科技有限公司。

1.2 主要儀器 蛋白電泳儀、核酸電泳儀、PCR擴增儀和熒光定量系統,均購自美國Bio-Rad公司;核酸蛋白測定儀、普通離心機和CO2恒溫培養箱,均購自美國Thermo Fisher科技有限公司;低溫離心機和手持移液器,均購自德國Eppendorf公司;凝膠成像系統,購自瑞士Roche公司;多功能微孔板檢測儀,購自瑞士Tecan公司。

1.3 實驗動物、質粒、菌種和細胞 8周齡C57BL/6J小鼠,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[生產許可證號:SCXK(京)2016—0011];pcDNA3.1-Flag和pGL4.10[luc2] 載體,均購自美國Promega公司;hBMAL1、mCLOCK、mPER2過表達質粒,由安徽大學秦曦明副教授饋贈;DH5α感受態細胞,購自北京天根生化科技有限公司;小鼠NIH3T3胚胎成纖維細胞和人胚腎HEK293T細胞,均由中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫提供。

1.4 生物信息學分析 從NCBI數據庫下載小鼠Usp2-45和Usp2-69的CDS區序列信息及其編碼蛋白的氨基酸信息,使用ExPASy ProtParam在線工具(https://web.expasy.org/protparam/)分析USP2-45和USP2-69蛋白的基本理化特性,包括氨基酸組成、分子式、理論等電點、脂肪族系數和蛋白親疏水性;利用SignalP 5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)和TMHMM-2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)分別分析USP2-45和USP2-69蛋白是否具有信號肽和跨膜結構;使用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)分別分析USP2-45和USP2-69蛋白的二級和三級結構。利用DNASTAR軟件對不同物種間的Usp2-45和Usp2-69的CDS區進行同源性分析,并利用MEGA 7軟件構建系統進化樹,NCBI數據庫中不同物種的Usp2-45和Usp2-69基因登錄號如表1所示。結合Ensembl網站公布的Usp2-45和Usp2-69序列信息,利用Consite網站預測分析Usp2-45和Usp2-69轉錄起始位點-2 000～+200 bp范圍內的啟動子區域是否具有生物鐘調控的順式作用元件。

表1 不同物種的Usp2-45和Usp2-69基因登錄號Table 1 Usp2-45 and Usp2-69 gene accession numbers in different species

1.5Usp2-45真核表達載體的構建

1.5.1 引物設計和合成 結合pcDNA3.1-Flag真核表達載體序列信息,以XhoⅠ為酶切位點(下劃線),使用SnapGene軟件設計含pcDNA3.1-Flag同源臂的小鼠Usp2-45 CDS區上、下游引物:F:5′-CGATATCGGATCCGGTACCCTCGAGGCCACCATGC-GTACCTCCTACACGGT-3′,R:5′-GGTCTTTGTAGTCACCGGTCTCGAGCATACGGGAGGGTGGAC-3′,引物交由西安擎科澤西生物科技有限責任公司合成。

1.5.2Usp2-45 CDS區目的片段擴增 稱取20 mg小鼠肝臟組織放入1 mL TRIzol中,組織勻漿后提取總RNA,經逆轉錄獲得cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增,反應體系為50 μL:cDNA 2 μL(<200 ng),10 μmol/L上、下游引物各1.5 μL,5×PrimeSTAR Buffer 10 μL,dNTP Mixture 4 μL,PrimeSTAR?HS DNA Polymerase 0.5 μL,補水至50 μL。反應程序:預變性98 ℃ 5 min;變性98 ℃ 10 s,退火55 ℃ 5 s,延伸72 ℃ 90 s,38個循環;終延伸72 ℃ 5 min,16 ℃結束反應。PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,對符合預期的目的條帶進行膠回收純化,獲得Usp2-45的CDS區。

1.5.3 重組質粒的構建和鑒定 對pcDNA3.1-Flag進行單酶切獲得線性化載體,將其與已酶切的Usp2-45的CDS區片段進行同源重組反應,反應體系為20 μL:pcDNA3.1線性化載體1 043 ng,Usp2-45 CDS區片段 76 ng,5×CE Ⅱ Buffer 4 μL,Exnase Ⅱ 2 μL,加去離子水補至20 μL;37 ℃孵育30 min。將獲得的重組產物進行轉化、涂板、挑取單克隆和增菌培養,選取菌落PCR鑒定正確的菌液提取質粒并進行酶切鑒定,將鑒定正確的質粒送至西安擎科澤西生物科技有限責任公司進行測序。將測序信息與NCBI數據庫已公布序列進行比對,正確的重組質粒命名為pcDNA3.1-Usp2-45-Flag。

1.5.4 重組質粒轉染NIH3T3細胞 將NIH3T3細胞接種于35 mm培養皿中,待細胞密度達70%～80%時進行轉染,對照組轉染pcDNA3.1-Flag空質粒,試驗組轉染pcDNA3.1-Usp2-45-Flag。將2 μg質粒與5 μL Turbofect轉染試劑加至100 μL Opti-MEM無血清培養基中,混勻并孵育15 min;滴加至培養皿中,混勻后置于37 ℃、5% CO2條件下繼續培養。

1.5.5 實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)檢測 轉染48 h后,提取細胞樣品總RNA并逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板進行qPCR反應,反應體系為20 μL:cDNA 5 μL,SYBR?qPCR Mix 10 μL,上、下游引物各1 μL,ddH2O 3 μL。反應程序:95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40個循環;95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。引物序列信息如表2所示,選擇36b4為內參基因,采用2-ΔΔCt相對定量法計算目的基因的表達變化。

表2 qPCR引物序列Table 2 Primer sequences for qPCR

1.5.6 蛋白質免疫印跡(Western blot,WB)檢測 轉染48 h后,收集細胞樣品并加入RIPA裂解液,提取細胞總蛋白。將蛋白樣品稀釋至同一濃度后,加入Loading Buffer煮沸使其變性。取20 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳,并將蛋白轉印至硝酸纖維素(Polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,10%脫脂奶粉封閉2 h,TBST洗滌后將PVDF膜分別置于兔抗FLAG抗體和鼠抗β-actin抗體中,4 ℃孵育過夜;TBST洗3次,每次10 min,將PVDF膜分別孵育HRP共扼羊抗兔抗體和HRP共扼羊抗鼠抗體,室溫搖床孵育1 h;TBST洗膜后,滴加ECL顯色液進行曝光,使用Image J軟件對蛋白條帶進行灰度分析。

1.6Usp2啟動子熒光素酶報告質粒的構建

1.6.1 啟動子引物設計和合成 利用Primer Premier 6.0軟件設計4對擴增Usp2-69和Usp2-45不同長度啟動子的引物,具體序列信息如表3所示。

表3 Usp2啟動子引物序列Table 3 Primer sequences of Usp2 promoter

1.6.2 啟動子片段的擴增 稱取100 mg小鼠肝臟提取全基因組,并以此為模板擴增Usp2-69和Usp2-45不同長度的啟動子區域,反應體系為50 μL:5×PrimeSTAR GXL Buffer 10 μL,dNTP Mixture 4 μL,上、下游引物各1 μL,模板2 μL(500 ng),PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1 μL,補加ddH2O至50 μL。反應程序:預變性98 ℃ 10 min;變性98 ℃ 10 s,退火55 ℃ 15 s,延伸68 ℃ 150 s,循環35次;終延伸68 ℃ 5 min,16 ℃ 保存。反應結束后進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,將目的條帶進行膠回收。

1.6.3 啟動子重組質粒的構建和鑒定 將獲得的Usp2-69、Usp2-45L、Usp2-45M和Usp2-45S啟動子片段酶切,酶切產物進行膠回收純化。將酶切后的啟動子片段、pGL4.10[luc2]與T4 DNA連接酶按比例混合,16 ℃連接過夜。后續經過轉化、涂板、挑取單克隆、搖菌,提取質粒、酶切鑒定、測序等步驟后,將鑒定正確的質粒分別命名為Usp2-69-Luc、Usp2-45L-Luc、Usp2-45M-Luc和Usp2-45S-Luc。

1.6.4 雙熒光素酶報告試驗 將HEK293T細胞接種于24孔板中,24 h后將Usp2-45L-Luc或Usp2-69-Luc重組質粒分別與hBMAL1、mCLOCK和mPER2過表達載體共轉染至細胞中,具體分組:(1)100 ng Usp2-45L-Luc或Usp2-69-Luc與600 ng pcDNA3.1空載體共轉染組;(2)100 ng Usp2-45L-Luc或Usp2-69-Luc與150 ng BMAL1、150 ng CLOCK過表達質粒和300 ng pcDNA3.1共轉染組;(3)100 ng Usp2-45L-Luc或Usp2-69-Luc與150 ng hBMAL1、150 ng mCLOCK、300 ng mPER2共轉染組。同時,為進一步驗證生物鐘核心轉錄因子BMAL1和CLOCK對Usp2-45啟動子的調控作用,分別將不同長度的Usp2-45啟動子(Usp2-45L-Luc、Usp2-45M-Luc和Usp2-45S-Luc)與BMAL1、CLOCK過表達質粒共轉染。以上處理組各轉染5 ng pRL-CMV海腎熒光素酶報告質粒(內參質粒),同時每個處理組設置3個復孔。轉染36 h后,按照雙熒光素酶報告實驗試劑盒說明書收集并處理細胞樣品,使用多功能酶標儀檢測并計算相對熒光值(螢火蟲熒光值÷海腎熒光值),數據測量3次取平均值。

1.7 數據統計分析 使用GraphPad Prism 6.0軟件對試驗數據進行統計學分析,結果以“平均值±標準誤”表示,兩組間樣本均值比較采取t檢驗,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 小鼠USP2蛋白的基本理化性質 小鼠USP2-45蛋白分子式為C1998H3138N564O590S23,由396個氨基酸組成,其中含量占比前3的氨基酸依次為亮氨酸(11.9%)、絲氨酸(9.3%)和精氨酸(8.1%);不穩定系數52.56,為不穩定蛋白;理論等電點為8.92,脂肪族系數為74.39;平均親水系數為-0.431,為親水性蛋白。USP2-69分子式為C3032H4761N881O942S28,由619個氨基酸組成,其中含量占比前3的氨基酸依次為絲氨酸(12.8%)、亮氨酸(10.0%)和精氨酸(8.9%);不穩定系數50.84,為不穩定蛋白;理論等電點為9.34,脂肪族系數為62.89;平均親水系數為-0.654,為親水性蛋白。SignalP 5.0和TMHMM-2.0軟件分析結果顯示,小鼠USP2-45和USP2-69均不存在信號肽,不存在跨膜結構。

2.2 小鼠USP2-45和USP2-69蛋白的二級和三級結構預測 預測結果顯示,α-螺旋、延伸鏈、β-轉角和無規則卷曲在USP2-45二級結構中分別占35.86%、15.91%、1.77%和46.46%,在USP2-69二級結構中分別占32.47%、9.69%、2.75%和55.09%。小鼠和人類的USP2-45和USP2-69蛋白三級結構預測結果如圖1所示,使用pyMOL軟件對小鼠USP2-45(圖1A)與人類USP2-45(圖1B)進行蛋白結構比對,結果顯示,原子位置均方根偏差(Root-mean-square deviation,RMSD)為0.032,兩者差異極小;同時,對小鼠USP2-69(圖1C)與人類USP2-69(圖1D)蛋白進行結構比對,RMSD為0.049,兩者差異極小。

圖1 小鼠和人類USP2-45和USP2-69蛋白的三級結構預測Fig.1 Tertiary structure prediction of USP2-45 and USP2-69 proteins in mouse and humanA:小鼠USP2-45蛋白三級結構預測; B:人類USP2-45蛋白三級結構預測; C:小鼠USP2-69蛋白三級結構預測; D:人類USP2-69蛋白三級結構預測A:Predicted tertiary structure of mouse USP2-45 protein; B:Predicted tertiary structure of human USP2-45 protein; C:Predicted tertiary structure of mouse USP2-69 protein; D:Predicted tertiary structure of human USP2-69 protein

2.3 小鼠Usp2-45基因同源性分析和進化樹構建 利用生物信息學軟件DNASTAR和MEGA 7對不同物種的Usp2-45 CDS區進行同源性分析和比對,結果如圖2A所示,小鼠Usp2-45的CDS區與其他9種物種的同源性均保持在89%以上,具有較高的相似性和保守性;系統進化樹如圖2B所示,小鼠Usp2-45轉錄本與大鼠的親緣關系最近,與狗和貓的關系較遠。

圖2 不同物種Usp2-45的CDS區同源性分析(A)和系統進化樹分析(B)Fig.2 Homology analysis (A) and phylogenetic tree analysis (B) of Usp2-45 CDS region in different species▲:本試驗中的小鼠Usp2-45基因NCBI登錄號▲:NCBI accession number of mouse Usp2-45 gene in this study

2.4 小鼠Usp2-69基因同源性分析和進化樹構建 同時,對不同物種的Usp2-69 CDS區進行同源性分析和比對,結果如圖3A所示,小鼠Usp2-69的CDS區與其他9種物種的同源性均保持在87%以上,具有較高的相似性和保守性;系統進化樹如圖3B所示,小鼠Usp2-69轉錄本與大鼠的親緣關系最近,與狗和貓的關系較遠。

圖3 不同物種Usp2-69 CDS區的同源性分析(A)和系統進化樹分析(B)Fig.3 Homology analysis (A) and phylogenetic tree analysis (B) of Usp2-69 CDS region in different species▲:本試驗中的小鼠Usp2-69基因NCBI登錄號▲:NCBI accession number of mice Usp2-69 gene in this study

2.5 pcDNA3.1-Usp2-45-Flag的構建 如圖4A所示,小鼠Usp2-45 CDS區的PCR擴增產物條帶單一,與預期大小相符(1 191 bp)。pcDNA3.1-Usp2-45-Flag的酶切鑒定結果如圖4B所示,瓊脂糖凝膠電泳后獲得的2條條帶與預期大小相符(Usp2-45 CDS:1 191 bp;pcDNA3.1-Flag:5 515 bp)。將酶切鑒定正確的質粒測序,測序結果與Usp2-45在NCBI數據庫公布的序列信息完全一致,表明pcDNA3.1-Usp2-45-Flag構建成功。

圖4 PCR擴增和酶切鑒定Fig.4 PCR amplification and enzyme digestion identification A:Usp2-45 CDS區的PCR擴增(M:DL2 000 DNA分子量標準; 1～4:PCR產物); B:pcDNA3.1-Usp2-45-Flag質粒酶切鑒定(M:DL5 000 DNA分子量標準; 1～2:酶切產物)A:PCR amplification of the Usp2-45 CDS region (M:DL2 000 DNA Marker; 1-4:PCR products); B:Enzyme digestion identification of pcDNA3.1-Usp2-45-Flag plasmid (M:DL5 000 DNA Marker; 1-2:Enzyme digestion products)

2.6Usp2-45在NIH3T3細胞中的過表達 分別將pcDNA3.1-Flag(對照組)和pcDNA3.1-Usp2-45-Flag(試驗組)轉染至NIH3T3細胞,qPCR結果如圖5A所示,試驗組的Usp2-45 mRNA表達水平極顯著高于對照組(P< 0.01);WB結果如圖5B所示,對照組在相應位置無條帶,而試驗組的USP2-45蛋白成功表達。

2.7 小鼠Usp2-45和Usp2-69的啟動子序列分析 利用Consite網站預測分析Usp2-45和Usp2-69轉錄起始位點-2 000～+200 bp范圍內的啟動子區域能夠與生物鐘核心轉錄因子BMAL1和CLOCK相互作用的關鍵順式作用元件。如圖6所示,Usp2-45啟動子區域存在2個典型的E-box(5′-CACGTG-3′),分別位于其轉錄起始位點上游-764～-769 bp和-1 389～-1 394 bp區域內;Usp2-69啟動子序列僅存在1個典型的E-box,位于其轉錄起始位點-153～-158 bp區域內。

圖6 小鼠Usp2-45和Usp2-69啟動子結構示意圖Fig.6 Schematic diagram of mouse Usp2-45 and Usp2-69 gene promotor structures

2.8 生物鐘選擇性調控Usp2-45和Usp2-69啟動子的轉錄活性 以小鼠基因組為模板,采用PCR擴增獲得Usp2-45L和Usp2-69的啟動子區域的DNA片段(Usp2-45L:-1 745～+259 bp,共2 004 bp;Usp2-69:-1 832～+196 bp,共2 028 bp)。將膠回收后的目的片段進行酶切并與pGL4.10[luc2] 載體相連,獲得Usp2-45L-Luc和Usp2-69-Luc重組質粒(結果未展示),用于雙熒光素酶報告試驗。如圖7A所示,BMAL1和CLOCK過表達質粒的共轉染極顯著提高了Usp2-45啟動子調控下的熒光素酶活性(P<0.01),生物鐘轉錄抑制因子PER2過表達后顯著抑制了Usp2-45啟動子調控下的熒光素酶活性(P<0.05);如圖7B所示,BMAL1、CLOCK和PER2過表達質粒的共轉染對Usp2-69啟動子調控下的熒光素酶活性均無顯著影響(P>0.05)。

圖7 Usp2-45(A)和Usp2-69(B)啟動子的雙熒光素酶報告試驗Fig.7 Dual-luciferase reporter assay of Usp2-45 (A) and Usp2-69 (B) promoters+:添加該質粒; -:不添加該質粒; *:P<0.05,**:P<0.01,ns:無顯著性差異; 下圖同+:Addition of the plasmid; -:No addition of the plasmid; *:P<0.05,**:P<0.01,ns:No significant difference. The same as below

2.9 生物鐘調控Usp2-45轉錄的啟動子功能區鑒定 為了鑒定生物鐘調控Usp2-45轉錄的啟動子功能區,在已構建Usp2-45L-Luc(-1 745～+259 bp,2 004 bp)熒光素酶報告質粒的基礎上,進一步成功構建了2種不同長度的Usp2-45啟動子熒光素酶報告質粒,即Usp2-45M-Luc(-1 109～+259 bp,1 368 bp)和Usp2-45S-Luc(-739～+259 bp,998 bp),啟動子序列和E-box元件位置信息如圖8 A所示。雙熒光素酶報告試驗結果顯示,BMAL1和CLOCK過表達質粒共轉染均極顯著提高了不同長度Usp2-45啟動子的熒光素酶活性(P<0.01),活性由強到弱依次為1 368、2 004和998 bp。值得注意的是,Usp2-45S-Luc對BMAL1/CLOCK過表達質粒的應答活性極顯著低于Usp2-45L-Luc和Usp2-45M-Luc(P<0.01)(圖8B)。上述結果提示,生物鐘調控Usp2-45轉錄的重要功能區位于其轉錄起始位點-740～-1 109 bp的范圍內。

圖8 雙熒光素酶報告試驗檢測不同長度的Usp2-45啟動子對BMAL1和CLOCK蛋白的應答活性Fig.8 Dual luciferase reporter assay examing the response activities of different lengths of Usp2-45 promoters to BMAL1 and CLOCK proteins A:Usp2-45L-Luc、Usp2-45M-Luc和Usp2-45S-Luc質粒結構示意圖; B:雙熒光素酶報告試驗A:Schematic diagram of Usp2-45L-Luc,Usp2-45M-Luc and Usp2-45S-Luc plasmid structure; B:Dual-luciferase reporter assay

3 討論

泛素化作為一種重要的蛋白翻譯后修飾過程,參與調控細胞周期、細胞增殖和凋亡、細胞分化、轉錄調控、信號傳導、損傷修復以及炎癥免疫等幾乎一切生命活動,在蛋白的定位和代謝等方面發揮重要作用[20,28]。真核生物體內80%～85%的蛋白降解依賴于泛素化-蛋白酶體途徑。同時,泛素化的可逆過程去泛素化在維持蛋白的穩定和細胞穩態方面具有重要意義。去泛素化酶USPs家族在此過程中扮演重要角色[29]。

作為USPs家族的成員,小鼠Usp2基因位于9號染色體(9A5.1),包含21個外顯子,經過可變剪接可產生9個轉錄本,但僅有7個轉錄本可以編碼蛋白[11]。Gousseva和Baker報道了小鼠Usp2基因的結構和組織表達模式,USP2主要存在USP2-45和USP2-69兩種蛋白亞型[12],但目前尚缺乏關于小鼠USP2蛋白結構和功能的深入研究。本試驗結果顯示,USP2-45包含396個氨基酸,USP2-69包含619個氨基酸,二者含量最多的前3種氨基酸均為絲氨酸、亮氨酸和精氨酸;USP2-45和USP2-69蛋白均無信號肽和跨膜結構,且在小鼠和人類兩物種之間的三級結構差異較小。不同物種的Usp2-45和Usp2-69同源性分析結果顯示,小鼠Usp2-45與其他9種物種的同源性均保持在89%以上,Usp2-69與其他9種物種的同源性均保持在87%以上;進化樹結果顯示,小鼠Usp2-45和Usp2-69轉錄本與大鼠的親緣關系最近。前期研究發現,大鼠中存在小鼠Usp2-45和Usp2-69的直系同源物,并將其命名為睪丸特異性和發育調節蛋白Ubp-t1和Ubp-t2,表明Usp2-45和Usp2-69基因在小鼠與大鼠之間具有較高的相似性和保守性[30]。

盡管USP2-45和USP2-69具有相似的結構和理化特性,二者在同一生理或病理過程中的功能表現卻存在明顯的差異[14,31]。Tao等通過干擾Usp2-69的表達顯著增加了前列腺癌、乳腺癌和結腸癌等細胞系的凋亡率,表明USP2-69具有抗凋亡功能[17];與之相反的是,Gewies等發現,在Hela細胞中過表達UBP41(根據氨基酸序列推斷其為USP2-45)可顯著誘導其凋亡[32]。前期研究證據表明,Usp2-45節律性表達于小鼠肝臟中,Usp2-69的表達卻無明顯的節律性變化,Bmal1肝臟特異性敲除小鼠肝臟中Usp2-45的表達幾乎完全喪失節律性變化,表明生物鐘系統對Usp2-45和Usp2-69具有不同的選擇性調控作用[13,33,34]。為深入探究生物鐘系統對Usp2-45和Usp2-69的選擇性調控機制,本試驗通過對Usp2-45和Usp2-69的啟動子區域預測分析發現,Usp2-45啟動子區域含有2個經典的E-box元件(位于-764～-769 bp和-1 389～-1 394 bp),而Usp2-69僅含有1個E-box元件(位于-153～-158 bp)。雙熒光素酶報告試驗結果顯示,BMAL1/CLOCK對Usp2-69啟動子無轉錄調控活性,但可正向調控Usp2-45的啟動子活性,這與Molusky等的研究結果一致[33]。本試驗進一步構建了2種不同長度的Usp2-45啟動子序列的熒光素酶報告質粒,即Usp2-45M-Luc(-1 109～+259 bp,1 368 bp)和Usp2-45S-Luc(-739～+259 bp,998 bp),結果顯示,BMAL1/CLOCK過表達質粒共轉染均極顯著提高了不同長度Usp2-45啟動子的熒光素酶活性,活性由強到弱依次為1 368、2 004和998 bp。上述結果表明,生物鐘調控Usp2-45轉錄的重要功能區位于其轉錄起始位點-740～-1 109 bp的范圍內。結合Koike等在2012年公布的ChIP-seq數據,以及NCBI數據庫的Usp2-45堿基序列分析,BMAL1蛋白與Usp2-45基因的結合位點集中在-1 000～-1 400 bp[35],而這與本試驗結果高度一致。但生物鐘系統調控Usp2-45節律性轉錄的具體分子機制有待后續更深入的研究。

本試驗分析了小鼠Usp2-45和Usp2-69轉錄本及其編碼蛋白的基本理化特性和結構功能,克隆了小鼠Usp2-45的CDS區,并成功構建了pcDNA3.1-Usp2-45-Flag真核表達載體。同時,本試驗成功構建了不同長度的Usp2啟動子熒光素酶報告載體,通過雙熒光素酶報告試驗檢測到BMAL1/CLOCK對Usp2-69啟動子活性無顯著影響,但可顯著提高Usp2-45的啟動子活性,且對啟動子區域中-740～-1 109 bp范圍內的功能位點調控作用更強,為后續深入研究生物鐘系統與USP2互作的分子調控機制提供了前期理論基礎和關鍵材料。