3株雞傳染性貧血病毒的分離鑒定、VP1基因遺傳進化分析及致病性評價

張 亞,胡小飛,段佳蕾,田 輝,孫 哲,霍環艷,薛景景,張盼濤,田克恭

(1. 國家獸用藥品工程技術研究中心,河南 洛陽 471000 ; 2. 普萊柯生物工程股份有限公司,河南 洛陽 471000)

雞傳染性貧血(Chicken infectious anemia,CIA)是由雞傳染性貧血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)引起的雛雞以貧血和免疫抑制為主要特征的傳染病。該病于1979年首次在日本被發現[1],我國于1992年由崔現蘭等[2]首次報道,此后全國各地陸續出現相關報道[3-5]。CIA發病特征主要表現為淋巴器官萎縮、骨髓細胞脂肪化和再生障礙性貧血[6]。育成雞群感染CIAV表現為生長遲緩、體重下降。若產蛋雞群在開產初期感染CIAV,會導致產蛋率上升緩慢;在產蛋高峰期感染該病毒則導致產蛋率下降10%～25%。種雞感染CIAV,可傳播給后代雛雞,造成雛雞死亡率增加。商品雞群感染CIAV則引起飼料轉化率下降、料肉比增加,嚴重影響經濟效益。CIAV的另一重大危害是與其他病原(如馬立克氏病病毒、網狀內皮組織增生征病毒、禽白血病病毒等)混合感染,可使CIAV的致病性增強,加劇雞群病癥表現,死亡率增加[7]。張言坤[8]研究顯示,CIAV感染可影響其他疫苗的免疫效力。

目前,CIAV只有1個血清型,但是不同地區CIAV分離株之間的基因組序列存在差異,毒力也有所不同[9,10]。CIAV基因組由單鏈環狀負鏈DNA組成,大小為2 298 bp或2 319 bp,共編碼3種病毒蛋白,分別為VP1、VP2和VP3[11]。VP1為病毒的主要結構蛋白,變異率最大,高變區為第139～151位氨基酸,Renshaw等[12]報道顯示,高變區內的第139和144位氨基酸在CIAV的繁殖和傳播中起重要作用;VP2為非結構蛋白,較為保守;VP3又稱為凋亡素,可誘導感染細胞發生凋亡。因此,VP1基因序列常被用來進行毒株的變異情況分析,關鍵氨基酸位點常被用來進行毒株的致病力分析。本試驗于2020年從江西省、寧夏回族自治區和山東省3個大型雞場采集的臨床樣品中分離CIAV,并對CIAV分離株進行VP1基因遺傳進化分析,以期對CIAV的流行、病毒的遺傳變異規律及防控技術研究提供理論和方法的參考。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品 共10份肝臟和脾臟組織樣品,于2020年分別采集自山東省、江西省和寧夏回族自治區3個疑似感染CIAV的養殖場,3個養殖場發病雞臨床表現均為精神沉郁、羽毛粗亂,部分雞只雞冠蒼白,剖檢肝臟和脾臟腫大。

1.2 SPF種蛋和SPF雞 SPF種蛋,購自濟南斯帕法斯家禽有限公司;SPF雞胚,購自濟南斯帕法斯家禽有限公司,于普萊柯生物工程股份有限公司[實驗動物生產許可證號:SCXK(豫)2014—0001]禽用負壓區動物房飼養至1日齡開展試驗。

1.3 主要試劑 DNA抽提試劑盒,購自旭基科技股份有限公司;DNA Marker和PremixTaq(ExTaqVersion 2.0 Plus Dye),均購自寶日醫生物技術有限公司;引物合成和基因測序,均由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.4 主要儀器 PCR儀(C1000 Touch)和凝膠成像系統(Gel Doc TMXR),美國伯樂公司產品;電泳儀(DYY-2C),北京六一生物科技有限公司產品;多樣品組織研磨器,上海凈信實業發展有限公司產品;負壓型安全隔離器,蘇州市馮氏實驗動物設備有限公司產品。

1.5 病毒分離培養和鑒定 取黃豆大小臟器組織樣品,剪碎,按照1∶1比例加入pH 7.4無菌PBS,充分研磨,按1∶5體積比加入含5 000 U/mL三抗(青霉素、鏈霉素和卡那霉素)的PBS,反復凍融3次,于2～8 ℃作用4 h,4 ℃、5 000 r/min離心10 min,收集上清并濾過除菌。取200 μL過濾病毒液用于基因組DNA提取,并進行PCR鑒定。PCR鑒定為陽性的病毒液,接種6日齡SPF雞胚,每胚0.2 mL,置于37 ℃孵育觀察14 d,收獲1～14 d死亡雞胚和14 d存活雞胚的肝臟組織。按上述相同方法研磨、凍融、離心、濾過除菌制備組織上清液,接種6日齡SPF雞胚,如此盲傳3代,提取第3代盲傳產物基因組DNA,以此為模板,進行PCR鑒定。引物序列、擴增條件和檢測方法均參照國家標準[13]進行,PCR產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果為陽性的病毒液置于-40 ℃保存備用。

1.6VP1基因序列擴增和測序 根據GD-101株(GenBank:KU050680)基因序列設計合成2對針對VP1基因的測序引物,引物名稱和序列見表1。參照病毒DNA抽提試劑盒說明書,提取病毒DNA,以其作為模板進行PCR擴增。PCR反應總體系50 μL:2×PremixTaq25 μL,上、下游引物各1 μL,模板2 μL,滅菌雙蒸水21 μL。PCR反應條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min 30 s,共35個循環;最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳確認并純化后,送公司測序。

1.7VP1基因序列分析和進化樹構建 應用Lasergene軟件,按照Clustal W計算方法,對分離獲得的VP1基因序列,與GenBank中CIAV參考毒株(參考毒株信息見表2)核苷酸序列進行比對。應用MEGA 6.0分析軟件進行VP1基因的系統發育分析,采用鄰位相接法(Neighbor-Joining)構建系統發育進化樹,用Bootstrap值評估進化樹的可靠性。

1.8 動物回歸試驗 取1.5獲得的所有陽性病毒液分別進行動物回歸試驗,根據陽性病毒液的數量進行動物試驗分組。將1日齡SPF雞隨機分為試驗組和對照組,每組10只,其中試驗組為病毒感染組,分組的數量依陽性病毒液的數量而定。試驗組以腿部肌肉注射方式分別接種0.2 mL病毒液(103.5EID50),對照組接種同樣劑量的pH 7.4無菌PBS。每日觀察雞只的臨床癥狀,試驗第14天于各組中隨機抽取3只雞采集抗凝血,比較對照組與試驗組血液變化。采血后剖檢雞只,觀察剖檢病變,同時將骨髓、胸腺、法氏囊用10%福爾馬林固定,經常規組織脫水、透明、包埋、切片,進行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin, H.E.)染色,顯微鏡下觀察并記錄病理變化。第21天將全部剩余雞只按上述同樣操作,進行觀察、采血、剖檢和組織病理學檢查。

2 結果

2.1 病毒分離培養和鑒定 將10份組織樣品按照1.5方法操作獲得第3代盲傳產物,以提取的基因組DNA為模板,進行PCR擴增。結果顯示,3份樣品擴增出675 bp條帶,與預期結果一致,為CIAV陽性;其余7份樣品無條帶產生,為陰性(圖1)。將分離獲得的3株陽性毒株分別命名為202006-JX-016、202006-NX-4-2和202006-SD-2-1。

圖1 病料樣品的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of diseased samplesM:DL2 000 Marker; +:陽性對照; -:陰性對照; 1～3:來自江西省的3份病料; 4～6:來自寧夏回族自治區的3份病料;7～10:來自山東省的4份病料M:DL2 000 Marker;+:Positive control;-:Negative control;1-3:Three diseased samples from Jiangxi;4-6:Three diseased samples from Ningxia;7-10:Four diseased samples from Shandong

2.2VP1基因序列擴增和測序 應用CIAV分段引物對3株分離毒株的VP1基因進行PCR分段擴增,擴增產物片段分別為1 499 bp和783 bp(圖2),與預期結果一致。將PCR產物測序、拼接后得到分離株VP1基因序列。

圖2 VP1基因序列的PCR擴增Fig.2 PCR amplification of VP1 gene sequenceA:VP1基因的PCR擴增片段1; B:VP1基因的PCR擴增片段2 (M:DL2 000 Marker; +:陽性對照; -:陰性對照; 1:202006-JX-016; 2:202006-NX-4-2; 3:202006-SD-2-1)A:PCR amplification fragment 1 of VP1 gene; B:PCR amplification fragment 2 of VP1 gene (M:DL2 000 Marker; +:Positive control;-:Negative control; 1:202006-JX-016; 2:202006-NX-4-2; 3:202006-SD-2-1)

2.3VP1基因序列分析和進化樹構建

2.3.1VP1核苷酸相似性分析 3株分離株202006-JX-016、202006-NX-4-2和202006-SD-2-1的核苷酸相似性介于97.7%～99.6%。202006-NX-4-2株與Ⅱ分支參考株核苷酸相似性介于97.8%～99.3%,與GX1804株相似性最高,且除與JL15120株相似性為97.8%外,與其他Ⅱ分支參考株相似性均在99.0%以上;202006-SD-2-1株和202006-JX-016株與Ⅱ分支參考株核苷酸相似性分別介于97.1%～99.6%和97.2%～99.5%,均與JL15120株相似性最高(圖3)。

2.3.2VP1基因氨基酸序列分析 將3株分離株和國內強毒株GD-101株的VP1基因氨基酸序列進行比對,發現202006-JX-016株、202006-NX-4-2株和202006-SD-2-1的株的毒力相關位點(第75、89、125、139、141、144和394位)均與GD-101株一致(表3)。

表3 202006-JX-016株、202006-NX-4-2株和202006-SD-2-1株氨基酸位點比較Table 3 Comparison of amino acid sites among strains 202006-JX-016,202006-NX-4-2 and 202006-SD-2-1

2.3.3 遺傳進化分析 將3株分離株VP1基因核苷酸序列與國內外參考株序列(表2)進行比對,構建VP1基因進化樹,結果顯示,進化樹由4個分支組成,3株分離株均屬于同一進化分支(Ⅱ分支),與經典株Cux-1株(Ⅰ分支)不屬于同一進化分支;202006-JX-016株和202006-SD-2-1株與JL15120株進化關系最近,202006-NX-4-2株與其他Ⅱ分支參考株有更近的遺傳距離(圖4)。

圖4 基于分離株VP1基因的遺傳進化樹Fig.4 Plylogenetic tree based on VP1 gene of the isolates●:本試驗分離株; ▲:疫苗參考株●:Strains isolated in this study; ▲:Vaccine reference strains

2.4 動物回歸試驗 選擇1日齡SPF雞對3株分離毒株進行動物回歸試驗,設定3個試驗組和1個對照組。結果顯示,202006-NX-4-2株試驗組8/8發病,感染后第11～14天死亡2只;202006-SD-2-1株試驗組8/10發病,感染后第18～19天死亡2只;202006-JX-016株試驗組10/10發病,感染后第19～20天死亡2只。臨床癥狀觀察結果顯示,與對照組相比,試驗組雞群精神萎靡、羽毛蓬亂、雞爪和雞冠蒼白。試驗第14和21天剖檢可見各試驗組均有明顯病變,表現為胸腺、法氏囊和脾臟萎縮,骨髓黃化,脾臟顏色變淡(圖5A),血液稀薄(圖5B)。病理切片結果顯示,骨髓中造血細胞和紅細胞數目明顯減少,胸腺和法氏囊中胸腺小葉/淋巴濾泡體積變小、明顯萎縮,淋巴細胞數目明顯減少、逸失(圖5C)。

3 討論

CIAV的VP1蛋白是核衣殼蛋白,并且是唯一的結構蛋白和主要的免疫原蛋白,可刺激機體產生較高的中和抗體。VP1基因的突變率最高,且有研究表明,基于CIAV全基因組和基于VP1基因構建的進化樹一致,而基于VP2和VP3基因構建的進化樹不能夠細致分群[14]。本試驗對2020年發病雞場采集的樣品進行CIAV的分離培養和特異性PCR檢測,獲得3株CIAV分離株,對其進行VP1基因測序和比對,結果顯示,3株CIAV分離株相似性介于97.7%～99.6%;202006-NX-4-2株與GX1804株相似性最高,且除與JL15120株相似性為97.8%外,與其他Ⅱ分支參考株相似性均在99.0%以上;202006-SD-2-1株和202006-JX-016株均與JL15120株相似性最高。進化樹分析結果顯示,3株CIAV分離株均屬于遺傳進化樹Ⅱ分支,與國內大多數CIAV病毒株屬同一分支。其中Ⅰ分支的Cux-1株是德國2008年分離株,我國早期分離株大多與其親緣關系較近[15],而從本試驗的毒株系統發育進化樹可以看出,3株分離株均與Cux-1株親緣關系較遠,分別處于2個不同的進化分支,說明目前我國流行毒株基因發生了變異。CIAV VP1蛋白的第394位氨基酸是病毒毒力強弱的主要決定因素,當該位點為谷氨酰胺(Q)時,病毒表現為高致病性,當該位點為組氨酸(H)時,病毒表現為低致病性[16]。本試驗分離的3株毒株在VP1蛋白第394位均為Q,提示3株分離株均為高致病性病毒株,而3株分離株動物回歸試驗均引起嚴重的淋巴器官萎縮、骨髓黃化、血液稀薄等病理變化也證實了這一點。

CIAV可以通過水平和垂直傳播,大日齡雞只感染后不會出現臨床癥狀,但該病毒可以垂直傳播給子代雞只,感染CIAV的子代雞只可引起繼發感染,影響其他疫苗的免疫效力。目前CIA主要通過免疫弱毒活疫苗進行預防,較多養殖場使用的弱毒活疫苗為德國Cux-1株疫苗。本試驗結果表明,該疫苗株與我國近期分離株的親緣關系較遠,對高致病性CIAV毒株引起CIA的保護作用較弱,不能滿足當前CIA預防和控制的需要。

本試驗結果提示,我國近幾年CIAV分離株已經發生變異,現有弱毒活疫苗在未來可能不適用于我國CIA的免疫預防。且弱毒活疫苗存在毒力返強風險,當務之急是研發更為安全有效的亞單位疫苗或核酸疫苗。本試驗為篩選我國當前流行病毒株和研發適合國內的更為有效的疫苗提供了科學依據和技術支撐。