豬圓環(huán)病毒2d亞型病毒樣顆粒的構(gòu)建和鑒定

劉兆祿,徐勝男,叢雁方,趙玉惠,蔣貽海

(1. 青島蔚藍生物股份有限公司,山東 青島 266102 ; 2.青島蔚藍生物制品有限公司,山東 青島 266114)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原體。自1991年加拿大首次報道PMWS以來[1],該病已蔓延至世界各地,是全世界養(yǎng)豬業(yè)面臨的重要傳染病之一[2],對于我國的養(yǎng)豬業(yè)同樣引起了巨大的經(jīng)濟損失[3]。該病主要癥狀表現(xiàn)為仔豬漸進消瘦,腹部乃至全身皮膚有斑塊,伴隨肺臟腫脹、淋巴結(jié)腫大和腎臟水腫等[4]。雖然通過改善飼養(yǎng)環(huán)境和減輕應激等方式可以避免感染豬的臨床癥狀,但不能完全抑制PCV2的感染[5]。目前,疫苗接種仍是預防PCV2感染最有效的手段。

PCV2基因組全長約1.7 kb,包含2個主要的開放閱讀框(Open reading frame,ORF):ORF1和ORF2。其中,ORF1主要編碼病毒復制相關(guān)蛋白Rep(Rep'),ORF2編碼PCV2唯一的結(jié)構(gòu)蛋白Cap[6,7]。Cap蛋白包含重要的抗原中和表位,能夠介導病毒的識別和入侵,是PCV2主要的免疫蛋白,并且在體外能夠自組裝成病毒樣顆粒(Virus-like particles,VLPs),是PCV2疫苗研制的重要靶蛋白[8]。

目前,市售的PCV2亞單位疫苗已被證明可有效預防PCV2的傳播,相比滅活疫苗,其抗原成分單一,不存在散毒的風險,對豬場PCV2的清除更具有優(yōu)勢[9]。近年來,通過流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn),PCV2優(yōu)勢流行毒株已開始從PCV2b亞型轉(zhuǎn)變?yōu)镻CV2d亞型[10],這種抗原性差異對于當前疫苗免疫保護和病毒基因進化的影響仍存在爭議。昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)具有安全性好,周期短,產(chǎn)量高,能夠?qū)ν庠吹鞍走M行翻譯后加工等優(yōu)點,并可使重組蛋白具有與病毒天然蛋白相似的結(jié)構(gòu)和活性,更有利于VLPs形成[11]。鑒于此,本試驗采用昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)表達PCV2d Cap蛋白,并對其進行表達鑒定和免疫原性分析,以期為研制有效新型的PCV2亞單位疫苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 pFastBac Dual-HBM質(zhì)粒、Sf9懸浮和貼壁細胞,均由本公司保存;2×Phanta Master Mix酶和ClonExpress Mix press無縫克隆酶,均購自南京諾唯贊股份有限公司;BamH I、XbaI、XhoI和NheI限制性內(nèi)切酶,均購自美國Thermo公司;DH5α感受態(tài)細胞,購自寶生物工程(大連)有限公司;DH10 Bac感受態(tài)細胞,購自北京華越洋生物有限公司;質(zhì)粒小提試劑盒,購自北京天根生物有限公司;病毒DNA/RNA共提取試劑盒,購自青島英賽特生物有限公司;HRP標記的羊抗鼠IgG,購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;FITC標記的IgG和Cellfectin?II Reagent轉(zhuǎn)染試劑,均購自美國Invitrogen公司。

1.2 主要儀器 層析柱(型號StarPack Mars SP HiRes 1 mL Column),購自蘇州星譜生物科技有限公司;PCR儀、紫外凝膠成像儀和熒光顯微鏡,均購自伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司;透射電子顯微鏡,購自上海日立高新技術(shù)國際貿(mào)易有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 基因合成 參考本實驗室分離的PCV2d毒株(GenBank登錄號:ABV21950.1)Cap蛋白基因序列,根據(jù)昆蟲細胞的偏好,對cap基因進行密碼子優(yōu)化,送至生工生物科技(上海)有限責任公司優(yōu)化合成。

1.3.2 引物設計和合成 昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)所用pFastBac Dual-HBM載體具有PH和P10兩個啟動子,因此,應用該表達系統(tǒng)可構(gòu)建含雙目的基因的重組供體質(zhì)粒。以優(yōu)化后cap基因為模板,分別針對pFastBacTMDual-HBM載體的PH和P10啟動子,進行引物設計,引物序列如表1所示。

表1 PCR擴增引物序列Table 1 Primer sequences for PCR amplification

1.3.3 目的基因的擴增 以cap基因為模板,分別應用PH-F/R、P10-F/R兩對引物進行PCR。PCR反應程序:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s、60 ℃退火40 s、72 ℃延伸90 s,共35個循環(huán);72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,回收并測定濃度,分別命名為PH-cap和P10-cap。

1.3.4 重組質(zhì)粒和穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶BamH I和XbaI對pFastBac Dual-HBM載體的PH啟動子下游序列進行雙酶切,并進行純化回收。利用ClonExpress Mix press無縫克隆酶將純化回收的載體與PH-cap片段按摩爾比1∶2于50 ℃反應15 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,挑取陽性菌落進行PCR鑒定,并送至生工生物科技(上海)有限責任公司測序,鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pFB-cap。用限制性內(nèi)切酶XhoI和NheI對pFB-cap的P10啟動子下游基因進行雙酶切,采用同樣的方式將線性化載體與P10-cap片段進行連接、轉(zhuǎn)化和測序鑒定,構(gòu)建含有雙cap基因的重組質(zhì)粒pFB-cap-cap。

將測序結(jié)果正確的pFB-cap-cap重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)細胞,經(jīng)藍白斑篩選,將陽性重組子進行PCR鑒定,鑒定正確的重組穿梭質(zhì)粒命名為rBacmid-cap-cap。

1.3.5 重組桿狀病毒的拯救和鑒定 按照Cellfectin?II Reagent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作,將穿梭質(zhì)粒rBacmid-cap-cap轉(zhuǎn)染至Sf9貼壁細胞內(nèi),27 ℃培養(yǎng)96 h后通過顯微鏡觀察細胞病變情況,并收獲細胞上清病毒液,命名為rBV-cap-cap。將P1代rBV-cap-cap接種Sf9細胞盲傳至P3代,收獲上清,4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ斋@的重組桿狀病毒進行基因組的提取,以全基因組為模板,PH-F/R為引物進行PCR鑒定。

1.3.6 間接免疫熒光試驗(Indirect immunofluorescence assay,IFA) 將P3代重組桿狀病毒接種至含單層Sf9細胞的24孔板中,27 ℃培養(yǎng)48 h;用-20 ℃預冷的80%冷甲醇室溫固定30 min;加入1∶100稀釋的本實驗室制備的Cap單抗,室溫孵育1 h;加入1∶200稀釋的FITC標記的羊抗鼠IgG,室溫避光孵育1 h,置于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.3.7 Western blot 將P3代重組桿狀病毒按1∶100體積比接種于Sf9懸浮細胞,27 ℃懸浮培養(yǎng)96 h,收獲細胞培養(yǎng)物。將細胞上清、破碎后上清和沉淀分別加入5×上樣緩沖液,100 ℃煮沸變性5 min,進行12% SDS-PAGE分離,半干法轉(zhuǎn)印至NC膜上,加入封閉液室溫封閉2 h;加入1∶80稀釋的本實驗室制備的Cap單抗,孵育1 h;加入HRP標記的羊抗鼠IgG,37 ℃孵育1 h;在NC膜上滴加曝光液進行曝光,分析蛋白表達情況。

1.3.8 PCV2d Cap蛋白的純化和鑒定 將200 mL P3代重組桿狀病毒離心,棄去上清,沉淀用PBS重懸,用細胞破碎儀勻漿破碎細胞,勻漿后混合液離心取上清備用。用去離子水清洗層析柱至少3個柱體積,去除柱內(nèi)20%保存液;用平衡液平衡層析柱至少3個柱體積,直至紫外吸收基線和電導檢測基線平穩(wěn)后,上樣200 mL Cap蛋白樣品,流速1 mL/min;用平衡液繼續(xù)淋洗層析柱,直至紫外吸收基線平穩(wěn);用洗脫液洗脫Cap蛋白。純化后的Cap蛋白進行SDS-PAGE鑒定。

1.3.9 Cap蛋白電鏡觀察 將純化后的PCV2d Cap蛋白滴加至電鏡專用銅網(wǎng)上,室溫吸附結(jié)合5 min,待銅網(wǎng)干燥后,用1%磷鎢酸染色2 min,吸去銅網(wǎng)邊緣多余液體,進行電鏡觀察,鑒定PCV2d VLPs的形態(tài)和大小。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴增 以PCV2dcap基因為模板,PH-F/R和P10-F/R分別為引物,進行PCR擴增,均獲得726 bp的目的條帶(圖1),與預計大小相符。

圖1 cap基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of cap geneM:DL-2 000 DNA 相對分子質(zhì)量標準; 1:陰性對照; 2:PH-cap基因片段; 3:P10-cap基因片段M:DL-2 000 DNA Marker; 1:Negative control; 2:PH-cap gene fragment; 3:P10-cap gene fragment

2.2 重組質(zhì)粒和重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建 獲得的重組質(zhì)粒pFB-cap-cap經(jīng)測序鑒定正確。重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-cap-cap的PCR鑒定結(jié)果如圖2所示,目的片段大小與預期結(jié)果相符,表明重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-cap-cap的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of recombinant bacmid rBacmid-cap-capM:DL-2 000 DNA 相對分子質(zhì)量標準; 1:陰性對照; 2:PH-cap基因片段; 3:P10-cap基因片段M:DL-2 000 DNA Marker; 1:Negative control; 2:PH-cap gene fragment; 3:P10-cap gene fragment

2.3 重組桿狀病毒的拯救和鑒定 重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細胞約96 h后,通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),細胞出現(xiàn)變大變圓并從培養(yǎng)皿中脫落等明顯病變現(xiàn)象(圖3)。提取P1代rBV-cap-cap基因組DNA經(jīng)PCR 鑒定為陽性(圖4)。

圖3 顯微鏡觀察Sf9細胞狀態(tài)(200×)Fig.3 Microscopic observation of Sf9 cell status (200×)A:Sf9細胞接毒96 h; B:正常Sf9細胞A:Sf9 cells infected for 96 hours; B:Normal Sf9 cells

圖4 重組桿狀病毒rBV-cap-cap的PCR鑒定Fig.4 PCR identification of recombinant baculovirus rBV-cap-capM:DL-2 000 DNA 相對分子質(zhì)量標準; 1:陰性對照; 2:PH-cap基因片段; 3:P10-cap基因片段M:DL-2 000 DNA Marker; 1:Negative control; 2:PH-cap gene fragment; 3:P10-cap gene fragment

2.4 PCV2d Cap蛋白表達的鑒定 將P3代重組桿狀病毒接種貼壁Sf9細胞,27 ℃培養(yǎng)48 h后進行IFA鑒定,結(jié)果顯示,接種rBV-cap-cap的Sf9細胞在熒光顯微鏡下能看到明顯的綠色熒光,而正常Sf9細胞無綠色熒光(圖5)。Western blot鑒定結(jié)果顯示,細胞培養(yǎng)上清、超聲破碎后上清和超聲破碎后沉淀均能檢測到28 kDa大小的特異性蛋白條帶(圖6)。以上結(jié)果表明,Cap蛋白在Sf9細胞中得到表達,且蛋白可分泌至培養(yǎng)液中,并且表達產(chǎn)物具有一定的反應原性。

圖5 Cap蛋白的間接免疫熒光鑒定(200×)Fig.5 Identification of Cap protein by indirect immunofluorescence assay(IFA) (200×)A:接種rBV-cap-cap的Sf9細胞; B:正常Sf9細胞A:Sf9 cells inoculated with rBV-cap-cap; B:Normal Sf9 cells

圖6 Cap蛋白的Western blot鑒定Fig.6 Identification of Cap protein by Western blotM:蛋白分子量標準; 1～3:分別為接種rBV-cap-cap的Sf9細胞培養(yǎng)上清、超聲破碎后上清和超聲破碎后沉淀; 4:正常Sf9細胞上清對照M: Protein Marker; 1-3: Culture supernatant, supernatant after ultrasonic disruption, and precipitate after ultrasonic disruption of Sf9 cells inoculated with rBV-cap-cap, respectively; 4: Normal Sf9 cell culture supernatant control

2.5 Cap蛋白的純化和鑒定 將重組桿狀病毒勻漿后收集細胞裂解液上清,經(jīng)陽離子柱純化Cap蛋白,利用SDS-PAGE鑒定純化后的目的蛋白,結(jié)果如圖7所示,純化后的樣品在28 kDa處有目的條帶。

圖7 純化后Cap蛋白的SDS-PAGE鑒定Fig.7 Identification of purified Cap protein by SDS-PAGEM:蛋白分子量標準; 1:純化后樣品; 2:未純化樣品;3:rBV-pFastBac Dual空桿對照M:Protein Marker; 1:Purified sample; 2:Unpurified sample;3:rBV-pFastBac Dual empty control

2.6 Cap蛋白電鏡觀察 將濃縮純化后的Cap蛋白進行電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)Cap蛋白能夠自組裝形成大小均一的、直徑為17～18 nm的VLPs(圖8)。

圖8 PCV2d VLPs電鏡觀察Fig.8 Electron microscopy observation of PCV2d VLPs

3 討論

PCV2自1998年在我國首次報道以來[12],現(xiàn)已廣泛流行于我國各大養(yǎng)豬場,其基因型的遺傳演化分析結(jié)果顯示,目前PCV2a、PCV2b、PCV2d三種基因型共存,以PCV2d為主要優(yōu)勢流行毒株,該毒株可引起更嚴重的豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(Porcine circovirus associated disease,PCVAD)[13]。PCV2主要通過免疫細胞侵入豬體,破壞免疫細胞和機體免疫功能,感染豬的免疫功能較低,無法形成有效的免疫應答來清除循環(huán)病毒。因此,對豬進行預防性免疫保護十分重要。目前,市面上的疫苗毒株和PCV2各亞型代表毒株全基因進化樹分析顯示,大部分疫苗毒株都屬于PCV2a和PCV2b亞型,只有SH毒株屬于PCV2d亞型[14,15]。針對當前流行毒株P(guān)CV2d的疫苗研發(fā),對提高現(xiàn)有疫苗免疫效力具有重大意義。

亞單位疫苗是將已知或者預測的某段或某幾段抗原表位插入不同表達體系內(nèi)大量表達所需多肽抗原的疫苗。Cap蛋白是PCV2唯一的結(jié)構(gòu)蛋白,含有多個PCV2的抗原表位,能夠在體外自發(fā)形成VLPs。Cap蛋白被證實可以誘導PCV2產(chǎn)生中和抗體,具有良好的免疫原性,成為近年來研制PCV2亞單位疫苗主要的免疫原性蛋白[16]。昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng)作為一種真核表達體系,可通過糖基化和磷酸化等修飾外源蛋白,使表達產(chǎn)物具有與天然蛋白相似的結(jié)構(gòu)和活性[17],并且桿狀病毒本身具有高度的種屬特異性,不感染哺乳動物,安全性高,是一種適用于獸用疫苗研究的表達系統(tǒng)[18]。其中,桿狀病毒載體滅活疫苗Ingelvac CircoFLEX?已于2006年上市,成為歐洲首個可同時保護仔豬和母豬的PCV2疫苗,英特威公司研制的Circumvent?和先靈葆雅公司研制的Porcilis?PCV滅活疫苗也均已實現(xiàn)商品化。

本試驗采用昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng),通過無縫克隆技術(shù)成功在體外表達PCV2d Cap蛋白,經(jīng)驗證其能夠與PCV2單克隆抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合,并且能自組裝形成VLPs結(jié)構(gòu),為進一步研究Cap蛋白的功能,研發(fā)更高效的PCV2d亞單位疫苗提供了新思路和參考依據(jù)。