河南部分地區不同免疫頻次下豬圓環病毒2型流行病學調查

龔 婷,侯文靜,馬 輝,鄭 鳴,蘇玉賢

(1.河南牧業經濟學院,河南 鄭州 450046 ; 2.平頂山市畜牧技術推廣站,河南 平頂山 467000)

豬圓環病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是導致斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)、豬皮炎和腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、母豬繁殖障礙(Peproductive failure)、豬呼吸道疾病綜合征(Porcine respiratory diseases complex,PRDC)和仔豬先天性震顫(Congenital tremor,CT)等豬圓環病毒相關疾病(Porcine circovirus associated disease,PCVAD)的主要病原體[1,2]。自1991年在加拿大首次報道PMWS以來,許多國家和地區都有該病發生的報道[3-5]。2000年,郎洪武等[6]首次報道了我國部分地區豬場感染PCV2,近年來,我國多個省份陸續報道了豬場出現PCV2感染的病例[7,8],防控形勢嚴峻復雜。PCV2主要侵害豬的淋巴組織器官,引起病豬免疫抑制,導致感染豬抗病力下降,容易共染或繼發感染其他病原微生物[9],給養豬業造成重大經濟損失。

目前,PCVAD尚無特效臨床治療藥物,常規疫苗接種是預防和控制豬群感染PCV2的重要手段。經過多年發展,規?；B豬成為主要的飼養生產方式。盡管規模豬場精細化管理有利于PCV2防控,但是,豬群PCV2感染發病的情況依然不斷發生。對豬群進行PCV2血清抗體監測和病原檢測分析是評價疫苗免疫效果、了解病毒感染狀況和制定免疫程序的主要指標,也是防控動物疫病的重要手段和制定有關政策的依據,可以更有效地預防疾病的發生。近幾年來,河南省部分地區有關PCV2疫苗接種后豬血清抗體流行病學調查的報道較多,但針對不同免疫頻次下PCV2疫苗免疫效果的研究罕見報道。為分析河南部分地區規?；i場PCV2流行現狀,了解不同免疫頻次下豬群PCV2流行特點,本試驗對2019—2021年采集的豬病料進行血清PCV2抗體和抗原核酸檢測,以期為養豬場防控PCV2感染提供參考。

1 材料與方法

1.1 血清來源 2019—2021年,在河南新鄉、平頂山、焦作等地區9家規?；i場前腔靜脈無菌采集豬全血1 454份,1份/頭,分離血清,-20 ℃保存備用。規模化豬場PCV2免疫情況和血清來源信息見表1。

表1 規?；i場PCV2免疫情況和血清來源信息Table 1 Information of PCV2 immunization status and serum sources in large-scale pig farms

1.2 主要試劑 PCV2抗體ELISA檢測試劑盒,購自上海酶聯生物科技有限公司;血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒、2×EasyTaq?PCR SuperMix和DL1 000 DNA Marker,均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 主要儀器 酶標儀,購自北京普朗新技術有限公司;基因擴增儀,購自珠海市祥臻生物科技有限公司;凝膠成像系統,購自伯樂生命醫學產品(上海)有限公司。

1.4 引物 按照豬圓環病毒聚合酶鏈反應試驗方法(GB/T21674—2008)[10]設計PCV2引物,引物序列:上游引物PCV2-F:5′-CCGCGGGCTGGCTGAA-3′,下游引物PCV2-R:5′-ACCCCCGCCACCGCTACC-3′,預擴增目的片段長度為 1 154 bp,引物使用濃度為10 μmol/L,引物由良培基因生物科技(武漢)有限公司合成。

1.5 血清PCV2抗體ELISA檢測 PCV2抗體檢測按照PCV2抗體ELISA試劑盒說明書操作。先用樣本稀釋液按1∶40倍稀釋血清樣本,然后37 ℃孵育30 min,洗滌5次,每孔加入100 μL羊抗豬酶標二抗,37 ℃孵育30 min,洗滌5次,每孔加入50 μL底物A液和B液,混勻避光顯色10 min,最后每孔加入50 μL終止液,振蕩60 min,10 min內在酶標儀上于450 nm波長處,以空白對照孔調零后,讀取各反應孔吸光度(Optical density,OD)。當陽性對照OD450值≥0.50,陰性對照OD450值≤0.20時試驗成立,計算結果判定:S/N 值≥2.10,判定血清樣本PCV2 抗體為陽性;S/N 值<2.10,判定血清樣本PCV2抗體為陰性。其中,S代表樣本OD值,N代表陰性對照 OD值。

1.6 血清PCV2核酸PCR檢測 取PCV2抗體陽性血清200 μL,按照血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取DNA,以提取的DNA為模板,利用PCR方法檢測PCV2。PCR反應體系:2×TaqPCR Master Mix 10 μL,上、下游引物各1 μL,模板2 μL,補足ddH2O 至20 μL。PCR反應程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共 30個循環;72 ℃ 10 min。PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,凝膠成像系統下觀察結果。

1.7 免疫密度指標計算和受檢豬群不同免疫情況分組 根據規?；i場2019—2021年受檢豬群的 PCV2疫苗免疫記錄情況,按公式(1)計算每年PCV2 疫苗免疫密度。

免疫密度(%)=年已免疫PCV2疫苗的樣本數÷年樣本總數×100%

(1)

根據受檢豬群的PCV2疫苗免疫不同頻次,將受檢豬群分為3個組,分別為未免疫組、免疫1次組、免疫≥2次組,通過分析比較各組豬群的血清PCV2抗體陽性率和核酸陽性率,揭示不同免疫頻次與豬群PCV2抗體陽性率之間的關系。

1.8 數據統計分析 利用SPSS 20.0軟件進行方差分析,統計分析不同年份抗體陽性率、免疫密度,以及不同免疫頻次下PCV2抗體陽性率和核酸陽性率。采用Bonferroni矯正χ2方法檢驗差異顯著性,P<0.05為差異顯著,P>0.05為差異不顯著。

2 結果

2.1 2019—2021年不同免疫密度下血清PCV2抗體陽性率 由表2可知,2019—2021年共檢測血清樣本1 454份,檢出抗體陽性樣本894份,總抗體陽性率為61.5%(894/1454),免疫樣本1 052份,免疫密度為72.4%(1 052/1 454)。2019年血清抗體陽性率和免疫密度分別為77.9%、91.1%,均顯著高于2020年和2021年(P<0.05)。結果表明,隨著免疫密度增大,PCV2抗體陽性率也隨之提高。

表2 2019—2021年PCV2疫苗免疫密度和血清抗體陽性率Table 2 PCV2 vaccine immunization density and serum antibody positive rate from 2019 to 2021

2.2 不同免疫頻次下血清PCV2抗體陽性率 由表3可知,未免疫組、免疫1次組和免疫≥2次組豬血清PCV2抗體陽性率分別為15.9%、74.2%和84.8%,未免疫組豬血清PCV2抗體陽性率顯著低于免疫1次組和免疫≥2次組(P<0.05),而免疫1次組和免疫≥2次組之間豬血清PCV2抗體陽性率差異不顯著(P>0.05);所有免疫豬的血清抗體平均陽性率為78.6%(831/1 057),顯著高于未免疫豬的血清抗體陽性率(15.9%,63/397)(P<0.05)。結果表明,未免疫豬場存在PCV2感染,隨著免疫次數增多,PCV2抗體陽性率相應升高,增加免疫頻次可以顯著提高血清PCV2抗體陽性水平。

表3 不同免疫頻次下血清PCV2抗體陽性率Table 3 Serum PCV2 antibody positive rate under different immunization frequencies

2.3 血清PCV2核酸PCR檢測 由表4可知,利用常規PCR方法對ELISA檢測出的894份抗體陽性血清進行PCV2核酸檢測,獲得106份PCV2核酸陽性血清,平均核酸陽性率為7.3%(106/1 454);未免疫組、免疫1次組和免疫≥2次組豬血清PCV2核酸陽性率分別為13.6%、5.0%和4.8%,免疫1次組和免疫≥2次組的PCV2核酸陽性率均顯著低于未免疫組(P<0.05),免疫1次組的核酸陽性率高于免疫≥2次組,但兩組差異不顯著(P>0.05)。結果表明,未免疫豬場PCV2感染比較嚴重,低水平PCV2抗體的豬群存在野毒感染的風險;隨著免疫頻次的增加,PCV2核酸陽性率呈下降的趨勢,這可能與PCV2疫苗免疫豬的抗體水平升高對 PCV2 抵抗力增強有關。

表4 不同免疫頻次下血清PCV2核酸陽性率Table 4 Serum PCV2 nucleic acid positive rate under different immune frequencies

3 討論

3.1 2019—2021年河南部分地區PCV2疫苗免疫形勢 在尚無特效藥物治療PCV2感染的情況下,有效的疫苗免疫接種是預防豬感染PCV2的主要手段,可以降低豬的病死率和發病率,提高豬的生產性能和養殖效益。因此,加強疫苗接種,提高免疫密度和血清陽性抗體水平,對于降低豬場PCV2感染風險,防控疫病流行具有關鍵作用。但是,本次調查中發現,每個豬場都曾經出現過免疫失敗的情況。在本次調查期間通過詢問畜主、查閱免疫記錄等方式了解到,免疫抑制病原的存在、疫苗質量不良、疫苗保存不當、操作錯誤、免疫程序不科學等是造成免疫失敗的原因。因此,為了防止免疫失敗情況的出現,必須及時監測免疫動物抗體水平,最好在免疫接種前、后分別對動物采血進行抗體水平檢測,并進行對比,及時了解免疫效果。本次調查對收集的1 454份血液樣本進行ELISA抗體檢測,結果發現,2019—2021年血清PCV2抗體陽性率分別為77.9%、39.3%和34.7%,血清PCV2抗體陽性率逐年降低,同時,免疫密度由2019年的91.1%下降到2021年的39.4%,表明血清抗體陽性率與免疫密度下降有關。分析其原因,除疫苗運輸、購買和使用受到新冠肺炎疫情影響外,疫苗價格居高不下、豬價低迷、免疫接種操作不規范、防疫意識較低等也可能是造成免疫密度下降的重要原因。

3.2 不同免疫頻次下血清PCV2抗體陽性率分析 本次調查中未免疫組、免疫1次組和免疫≥2次組豬血清PCV2抗體陽性率分別為15.9%、74.2%和84.8%;免疫豬的抗體平均陽性率顯著高于未免疫豬的抗體平均陽性率(P<0.05)。連慧香等[11]報道顯示,2014—2016年豫南地區免疫豬場的PCV2抗體陽性率(72.57%)高于未免疫豬場的PCV2抗體陽性率(35.56%)。羅麗華等[12]對陜西部分豬場進行PCV2抗體檢測發現,免疫豬場血清PCV2抗體陽性率為85%,非免疫豬場為43%。潘奕凡等[13]研究發現,豬場PCV2疫苗免疫在未免疫、免疫1次和免疫≥2次情況下,PCV2抗體陽性率分別為32.4%、66.0%和86.5%。周華林等[14]報道顯示,PCV2疫苗雙針免疫組效果明顯優于單針免疫組,可顯著降低豬發病率和死亡率。這些研究結果與本調查結果基本相一致,表明隨著免疫頻次的增加,血清抗體陽性水平升高,有利于提高豬機體抵抗PCV2的能力,降低感染概率。

3.3 血清PCV2核酸PCR檢測分析 盡管疫苗是有效防控PCVAD的主要手段,但是不能清除豬機體內已感染的PCV2,無法徹底阻斷PCV2流行,不能防止野毒感染[15],豬的PCV2抗體水平不能準確反映豬場PCV2感染的實際情況。這可能與PCV2主要寄生在淋巴免疫細胞,并且抗體無法有效突破固有的免疫屏障有關[16-18]。因此,需要檢測機體內是否存在PCV2,才能了解豬場PCV2流行特點,進而實施有效的防控措施。PCV2核酸陽性豬可能處于隱性感染狀態,一旦產生其他誘發因素或者致病因子、免疫功能嚴重抑制,則可能很快發病。而這些隱性感染的帶毒豬可通過分泌物和排泄物持續排毒,使病毒在豬群中長期存在[19]。本調查結果顯示,1 454份血清樣本中有106份為PCV2核酸陽性,陽性率為7.3%(106/1 454);其中,未免疫組、免疫1次組和免疫≥2次組豬群的PCV2核酸陽性率分別為13.6%、5.0%和4.8%;免疫豬場PCV2核酸陽性率顯著低于未免疫豬場PCV2核酸陽性率,且增加免疫頻次后PCV2核酸陽性率有下降的趨勢。這可能與疫苗免疫提高豬機體PCV2陽性抗體水平,增強抵抗力有關。提示應強化PCV2疫苗免疫,盡量增加免疫頻次,延長抗體在機體內存留時間,以降低豬場發生PCV2感染的風險。

綜上所述,本試驗對2019—2021年不同免疫頻次和免疫密度豬群進行PCV2感染情況調查,結果顯示,河南部分地區豬場PCV2疫苗免疫密度和抗體陽性率呈現逐年下降趨勢,未免疫豬PCV2核酸陽性率顯著高于免疫豬。因此,PCV2防控形勢不容樂觀,應引起重視,可通過增加免疫次數以提高PCV2抗體水平,從而降低PCV2核酸陽性率,減少豬感染PCV2的風險。