浙江省豬圓環病毒2型流行株遺傳變異分析

張 璐,安慧婷,王雅婷,黃 靖,張紅麗,董建斐,孫仁杰,劉 霞,趙靈燕,徐 輝,謝榮輝

(浙江省動物疫病預防控制中心,浙江 杭州 311199)

豬圓環病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)為無囊膜、單股負鏈環狀DNA病毒,可引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征、豬皮炎與腎病綜合征、增生性壞死性腸炎和繁殖障礙等多種疾病,該病原體已在全球流行,給養豬業造成了巨大的經濟損失[1-3]。PCV2包含11個重疊的開放閱讀框(Open reading frames,ORFs),其中ORF1和ORF2為2個主要開放閱讀框,ORF1基因編碼與病毒復制相關的蛋白;ORF2基因編碼病毒主要的結構蛋白——衣殼蛋白(Capsid,Cap),該蛋白參與宿主免疫應答,是病毒主要的免疫原性蛋白[4,5]。由于PCV2基因具有較高的突變率和重組率,導致新的PCV2變異株不斷出現[6-9],根據PCV2全基因組和ORF2基因分型,PCV2可分為PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e、PCV2f、PCV2g和PCV2h共8個基因型,各基因型之間存在抗原差異[10]。因此,對不同地區的PCV2流行毒株開展基因序列分析,有助于了解不同地區PCV2的分子流行病學特征及其遺傳變異情況。為了進一步了解近年來浙江省內的PCV2流行毒株和變異狀況,為科學選擇疫苗和有效防控PCV2提供依據,本試驗對2021年采自浙江省各地的PCV2陽性組織病料進行了PCV2全基因組擴增、克隆、測序和遺傳變異分析。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DNA凝膠回收試劑盒MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit、ExTaq酶、DL2 000 DNA Marker、DH5α感受態細胞和X-gal,均購自寶生物工程(大連)有限公司;pGEM?-T Easy Vector Systems,購自Promega公司;病毒核酸提取試劑盒MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Small Volume Kit,購自Roche公司;LB固體培養基、LB液體培養基、異丙基硫代半乳糖苷,均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 主要儀器 熒光定量PCR儀(型號ViiA 7),為ABI公司產品;PCR儀(型號 Mastercycler nexus)、冷凍高速離心機(型號5430R),為Eppendorf公司產品;全自動核酸提取儀MagNA Pure 96,為Roche公司產品。

1.3 組織樣品采集和處理 為了監測PCV2遺傳變異狀況,收集2021年浙江省杭州市、寧波市、溫州市、湖州市、紹興市、金華市、衢州市、麗水市和嘉興市無害化處理場和屠宰場經熒光定量PCR鑒定的PCV2陽性組織病料。取適量的組織病料剪碎,加1 mL無菌PBS緩沖液進行研磨,凍融3次,10 000 r/min離心5 min,取上清液置于-80 ℃冰箱中備用。

1.4 引物設計與合成 根據GenBank中PCV2基因序列,設計PCV2全基因組擴增引物(PCV2-FF491:5′-GAACCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT-3′,PCV2-FR470:5′-GCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3′),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5 PCV2全基因組擴增、克隆和測序 按照病毒核酸提取試劑盒說明書提取經處理的組織病料中的病毒核酸。以提取的病毒核酸為模板,利用引物PCV2-FF491和PCV2-FR470擴增PCV2全基因組片段。PCV2全基因組擴增反應體系(50 μL):10×ExTaqBuffer 5 μL,ExTaq0.25 μL,PCV2-FF491 1 μL,PCV2-FR470 1 μL,dNTP Mixture 4 μL,模板5 μL,無RNA酶水33.75 μL。PCR反應程序:94 ℃預變性1 min;98 ℃變性 10 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,共35個循環;最后72 ℃延伸10 min。對PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。按照試劑盒說明書切膠回收目的基因片段,并將目的基因克隆至pGEM?-T Easy載體,轉化DH5α感受態細胞,在含有氨芐青霉素的LB平板上培養18～24 h。挑選并擴增單菌落,采用菌落PCR方法篩選重組菌株。將含目的基因片段的重組菌株送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.6 PCV2全基因組和ORF2基因序列分析 利用DNASTAR軟件分析本試驗獲得的PCV2流行株與不同國家和地區的參考毒株(表1)之間的全基因組和ORF2基因核苷酸序列,及其推導的Cap蛋白氨基酸序列,以分析各毒株之間全基因組和ORF2基因核苷酸序列同源性及Cap蛋白氨基酸序列同源性。采用Mega 7軟件中的鄰接法(Neighbor-joining method)構建遺傳進化樹。

表1 本試驗參考毒株信息Table 1 Information of the reference strains in the study

2 結果

2.1 PCV2全基因組同源性和遺傳進化分析 對PCV2陽性病料進行PCV2全基因組擴增、克隆和測序,共獲得浙江省內不同地區的27株PCV2流行株全基因組序列。PCV2全基因組序列分析結果顯示,27株PCV2流行株全基因組核苷酸序列長度介于1 766～1 777 bp,其中1株為1 766 bp、18株為1 767 bp、7株為1 768 bp、1株為1 777 bp。27株PCV2流行株之間全基因組核苷酸序列同源性為91.0%～99.9%,與不同國家和地區的PCV2參考株之間的核苷酸序列同源性為90.7%～ 99.9%。其中與PCV2a代表株(GX0841a、HN-LH-2018、HN-JY-2015)核苷酸序列同源性為91.1%～99.6%;與PCV2b代表株(CL02、SD-QH、ZJ)核苷酸序列同源性為92.1%～99.9%;與PCV2c代表株(DK1980PMWSfree、DK1987PMWSfree)核苷酸序列同源性為92.5%～95.0%;與PCV2d代表株(TJ、SH、SDWH1809、ZB2811)核苷酸序列同源性為92.3%～99.9%;與PCV2e代表株(NE-001、USA/45358/2015)核苷酸序列同源性為90.7%～99.7%;與PCV2f代表株(YN-8、MZ-5、GD18/1999)核苷酸序列同源性為92.0%～96.8%;與PCV2g代表株(ZrBd_wb UKR、P2425 NT、YL5)核苷酸序列同源性為93.1%～97.1%;與PCV2h代表株(PCV2Izn-89-13、HD1-9、HUN-11)核苷酸序列同源性為91.7%～97.2%;與疫苗株(LG、ZJ、DBN-SX07-2)核苷酸序列同源性為91.1%～98.5%。

進化樹分析結果顯示,27株PCV2流行株分布于4個分支,其中8株PCV2流行株與參考毒株GX0841a、HN-LH-2018和HN-JY-2015親緣關系較近,處于同一簇,為PCV2a基因型毒株;6株PCV2流行株與參考毒株CL02、SD-QH、ZJ和DBN-SX07-2親緣關系較近,處于同一簇,為PCV2b基因型毒株;12株PCV2流行株與參考毒株TJ、SH、SDWH1809和ZB2811親緣關系較近,處于同一簇,為PCV2d基因型毒株;1株PCV2流行株與參考毒株NE-001和USA/45358/2015親緣關系較近,處于同一簇,為PCV2e基因型毒株(圖1)。

2.2 PCV2ORF2基因核苷酸及其推導的氨基酸序列分析 PCV2ORF2基因核苷酸序列分析結果顯示,16株PCV2流行株ORF2基因長度為702 bp,編碼233個氨基酸;10株PCV2流行株ORF2基因長度為705 bp,編碼234個氨基酸;1株ORF2基因長度為717 bp,編碼238個氨基酸。27株PCV2流行株之間ORF2基因核苷酸序列同源性為81.7%～99.9%,Cap蛋白氨基酸序列同源性為80.8%～100%;與不同國家和地區PCV2參考株之間的核苷酸序列同源性為81.8%～100%,Cap蛋白氨基酸序列同源性為80.8%～100%;其中與PCV2a代表株(GX0841a、HN-LH-2018、HN-JY-2015)的核苷酸序列同源性為81.8%～100%,Cap蛋白氨基酸序列同源性為80.8%～100%;與PCV2b代表株(CL02、SD-QH、ZJ)核苷酸序列同源性為84.4%～100%,Cap蛋白氨基酸序列同源性為83.4%～100%;與PCV2c代表株(DK1980PMWSfree、DK1987PMWSfree)核苷酸序列同源性為86.8%～90.8%,Cap蛋白氨基酸序列同源性為82.9%～88.9%;與PCV2d代表株(TJ、SH、SDWH1809、ZB2811)核苷酸序列同源性為 84.2%～100%,Cap蛋白氨基酸序列同源性為81.7%～100%;與PCV2e代表株(NE-001、USA/45358/2015)核苷酸序列同源性為81.2%～99.9%,Cap蛋白氨基酸序列同源為性為80.8%～100%;與PCV2f代表株(YN-8、MZ-5、GD18/1999)核苷酸序列同源性為83.4%～94.0%,Cap蛋白氨基酸序列同源性為83.4%～94.5%;與PCV2g代表株(ZrBd_wb UKR、P2425 NT和YL5)核苷酸序列同源性為85.5%～94.8%,Cap蛋白氨基酸序列同源性為83.8%～95.7%;與PCV2h代表株(PCV2Izn-89-13、HD1-9、HUN-11)核苷酸序列同源性為83.8%～95.3%,Cap蛋白氨基酸序列同源性為83.8%～96.6%;與疫苗株(LG、ZJ、DBN-SX07-2)核苷酸序列同源性為82.5%～99.4%,Cap蛋白氨基酸序列同源性為81.2%～98.7%。PCV2ORF2基因進化樹分析結果顯示,27株PCV2流行株分布于4個分支,其中8株屬于PCV2a基因型分支;6株屬于PCV2b基因型分支;12株屬于PCV2d基因型分支;1株屬于PCV2e基因型分支(圖2)。

圖2 PCV2 ORF2基因核苷酸進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on PCV2 ORF2 gene nucleotide sequences

27株PCV2流行株 Cap蛋白在糖基化位點(aa 143～145)和核定位信號區(aa 12～18和aa 34～41)呈高度保守,未發生突變。與3株疫苗株Cap蛋白氨基酸序列比對發現,27株PCV2流行株在Cap蛋白的B細胞抗原表位區(aa 47～63、65～87、113～139、165～200、C端最后4個氨基酸)[11,12]和T細胞表位區[13](aa 61～160、210～230)存在多個氨基酸突變(圖3)。本試驗獲得的8株PCV2流行株具有PCV2a基因型典型氨基酸序列TNKISI(aa 86～91),6株PCV2流行株具有PCV2b基因型典型氨基酸序列SNPRSV(aa 86～91),11株PCV2流行株具有PCV2d基因型典型氨基酸序列SNPLTV(aa 86～91)和TGID(aa 190、191、206、210)(圖3)。

圖3 PCV2 ORF2基因編碼的氨基酸序列分析Fig.3 Analysis of amino acid sequences encoded by ORF2 gene

3 討論

目前,PCV2在世界各國廣泛流行,給養豬業造成了巨大的經濟損失。根據PCV2全基因組核苷酸序列可將其分為8個基因型,即PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e、PCV2f、PCV2g和PCV2h。2000年以前,我國流行的PCV2基因型主要以PCV2a為主;2003—2012年,PCV2b成為我國主要的流行毒株,2012年以后,我國流行的PCV2b基因型逐漸向PCV2d基因型轉變,同時存在著PCV2a、PCV2b、PCV2e和PCV2h等多個基因型毒株[8,14-18]。本試驗共獲得27株PCV2流行株,8株為PCV2a基因型毒株、6株為PCV2b基因型毒株、12株為PCV2d基因型毒株、1株為PCV2e基因型毒株,其中PCV2d基因型毒株占比達44.44%(12/27),表明PCV2d基因型毒株為浙江省優勢毒株,這與近年來國內主要流行PCV2d基因型毒株的報道一致[19-23]。

ORF2基因編碼的衣殼蛋白(Cap蛋白)為PCV2主要結構蛋白,介導了病毒復制和宿主免疫應答,具有高度的變異性,Cap蛋白部分氨基酸的突變可導致抗原變異或毒力改變[5,8,24,25]。本試驗中27株PCV2流行株ORF2基因核苷酸及其推導氨基酸序列同源性分別為81.7%～99.9%和80.8%～100%;與PCV2參考株ORF2基因核苷酸及其氨基酸序列同源性分別為81.8%～100%和80.8%～100%,表明浙江省PCV2毒株發生了不同程度的變異。Cap蛋白氨基酸序列分析結果顯示,27株PCV2流行株的Cap蛋白存在著3個主要突變區(aa 47～92、120～139、185～232)。研究表明,Cap蛋白第77位和第206位氨基酸是抗體識別的關鍵位點,該位點的突變可影響抗體對PCV2毒株的識別[4]。與3株疫苗株(LG、ZJ、DBN-SX07-2)的Cap蛋白氨基酸序列相比,本試驗中部分毒株Cap蛋白第77位和第206位發生變異,可能導致其可逃避疫苗的免疫保護。

本試驗獲得的8株PCV2a基因型流行株與3株疫苗株Cap蛋白氨基酸序列的同源性為88.0%～91.5%;6株PCV2b基因型流行株與3株疫苗株Cap蛋白氨基酸序列的同源性為90.6%～98.7%;12株PCV2d基因型流行株與3株疫苗株Cap蛋白氨基酸序列的同源性為89.7%～94.0%;1株PCV2e基因型流行株與3株疫苗株Cap蛋白氨基酸序列的同源性僅為81.2%～84.6%,同源性較低。目前,國內商品化疫苗多基于PCV2a和PCV2b基因型而研制,研究表明,該類型的疫苗對PCV2a、PCV2b和PCV2d毒株具有良好的保護效果[26,27],但對國內新出現的PCV2e和PCV2f保護效果如何有待于進一步研究。